蛋白質(zhì)印跡法中免染技術(shù)和總蛋白定量方法的研究進展

1、蛋白質(zhì)印跡法中免染技術(shù)和總蛋白定量 方法的研究進展韓欣霖 楊佳儒 寶福凱 柳愛華 昆明醫(yī)科大學(xué)云南省高校熱帶傳染病重點實驗室星 明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系昆明醫(yī)科大學(xué)生 物化學(xué)與分子生物學(xué)系云南省公共衛(wèi)生與疾病防控 協(xié)同創(chuàng)新中心昆明醫(yī)科大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所云南 省熱帶病示范型國際科技合作基地摘要: 當含有蛋白質(zhì)的sds-page膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中時，經(jīng)三氯化合物的作用, 使得蛋白質(zhì)中的色氨酸經(jīng)紫外光照射會發(fā)出可見光，因而可在sds-page凝膠上 實現(xiàn)對蛋白質(zhì)條帶的定位與定性。免染技術(shù)即是基于此原理而發(fā)明的?；诿馊?技術(shù)，我們可以檢測到待測樣甜中的總蛋口條帶的光密度，進而利用目的蛋口

2、 條帶光密度與總蛋白條帶光密度的比值對目的蛋白進行定量。本文就蛋白質(zhì)印跡 法技術(shù)中的免染技術(shù)和總蛋白定量方法的原理和優(yōu)勢進行簡要綜述。關(guān)鍵詞：免染技術(shù);b 肌動蛋口（b -actin） ; b 微管蛋口（b-tublin）; 甘油醛3- 磷酸脫氫酶（gapdh）;總蛋白定量;作者簡介:韓欣霖(1992-),女，碩士研究生;作者簡介:楊佳儒(1987-),男，碩士研究生;作者簡介:寶福凱,(e-mail)baofukeiikmmu. edu. cn;作者簡介:柳愛華,(e-mail)liuaihua.kmmu. edu. cn收稿日期：2017-04-01 基金：國家自然科學(xué)基金（8137183

3、5, 31560051, 81560596）progress of stain-free technology and total protein analysis in western blottinghan xinlin yang jiaru bao fu-kai liu ai-huayunnan province key laboratory for tropicalinfectious diseases in universities, kunmingmedical university;abstract：based on the principle that after uv sti

4、mulation, the tryptophan will emit visible light when a sdspage gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform, the stain-free technology was invented. by means of stain-free technology, we can examine the optical density (od) value of total protein in seimples and then,

5、 we can quantify the target protein through utilizing the od value ratios between targct protein and total proteins. here, we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.keyword：stain-free technology; b -actin; b -tublin; gapdh; total pr

6、otein analysis;received： 2017-04-01自1979年首次應(yīng)用以來，蛋h質(zhì)印跡法(western blot)已成為測定復(fù)雜生物 樣品屮蛋口質(zhì)相對表達的關(guān)鍵技術(shù)。使用western印跡的生物化學(xué)分析是確定復(fù) 雜生物樣品中相對蛋白表達量的重要工具western印跡通常與大規(guī)模篩選技術(shù) 如蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合使用，以確認各種疾病模型中不同目的蛋白的表達ul雖然 成像和試劑技術(shù)在不斷提高靈敏度、動態(tài)檢測范圍和多重目標檢測的適用性方面 已經(jīng)取得了顯著進步，但是在最基本的技術(shù)上幾乎沒有變化。在過去，蛋白質(zhì)印 跡僅用于檢測復(fù)雜混合物屮的特定靶蛋口，但是現(xiàn)在許多學(xué)術(shù)期刊要求作者在 樣品之

7、間蛋白質(zhì)表達的倍數(shù)變化方面對western印跡數(shù)據(jù)進行定量解釋也。近 年來開發(fā)了新方法，涵蓋了完整的western c3跡工作流程，重點是樣品制備和 數(shù)據(jù)分析的定量免疫印跡方法。1內(nèi)參蛋白定量和總蛋白定量的比較蛋口質(zhì)印跡用于特異性地測量復(fù)雜生物樣品屮口蛋口的相對表達量。定量測量可 能由于過程不一致而產(chǎn)生誤差，例如轉(zhuǎn)膜時蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不均勻，包括樣品制備 和加樣錯誤，以及轉(zhuǎn)膜時蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不均勻。這些非樣本相關(guān)誤差需要通過歸一 化的方法來彌補。目前通常采用2種數(shù)據(jù)標準化方法：內(nèi)參蛋白(house keeping protein, hkp)標準化和總蛋白標準化(total protein normal

8、ization, tpn)3。1. 1 b -actin等內(nèi)參蛋白在western印跡實驗中不是一個可靠的上樣對照£41傳統(tǒng)上，由于缺乏累積發(fā)光線性和有限的定量再現(xiàn)性，使用ecl (增強化學(xué)發(fā)光) 的western卬跡被稱為半定量技術(shù)巨1。隨著更敏感的熒光標記的發(fā)展，其表現(xiàn) 出比常規(guī)ecl檢測更大的可量化的線性范圍、靈敏度和穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)表達的分 析可以被合理地稱為“定量”凹。因此，必須以更高的精確度確保樣品上樣的 均勻性，以避免在使用這些更高分辨率的工具時錯課的數(shù)據(jù)采集£11。為了準確 測量樣品中的蛋白質(zhì)水平，“上樣對照(loading control) ”蛋白質(zhì)通常用作

9、 內(nèi)參。上樣對照通常來自普遍表達的看家基因，并且由于它們在不同范圍的樣品 中特定的一致的表達水平而被廣泛使用。b肌動蛋白(b-actin)和甘油醛3- 磷酸脫氫酶(gapdii)是生物醫(yī)學(xué)研究屮最常用的2種內(nèi)參對照，然而越來越多 的研究表明它們在動物和實驗?zāi)Ｐ椭械谋磉_存在差異眩 已有研究表明，在運動神經(jīng)元病癥脊髓性肌萎縮(sma)的小鼠模型的病理學(xué)影 響的組織中，3-actin和13-tublin差異表達12-13。該研究使用建立的嚴重 sma的小鼠模型，從中得到脊髓組織，來量化p-actin和b-tublin的蛋白表 達水平。當使用western印跡定量(qwb)來比較sma小鼠受影響的脊髓

10、與對照 組織時，發(fā)現(xiàn)了 3 -actin和p -tublin表達水平的改變。與對照組織相比，sma 組織中的3-actin和3-tublin表達顯著下調(diào)。該研究從一系列疾病模型的受 累組織中可以檢測到對照蛋白表達的顯著改變，鑒定了健康(野牛型)組織中 內(nèi)參蛋白表達的差異性，并口確定了在同一個體內(nèi)不同組織中內(nèi)參蛋白的表達 同樣存在差異。該實驗使用c57b1/6 (野生型)小鼠的研究表明，當比較同一小 鼠的不同組織時，3-actin的表達顯著不同。在心臟和脾臟組織之間觀察到3-actin蛋白表達的顯著差異，當比較這些組織時，將數(shù)據(jù)歸一化用于不同組 織比較，3-actin蛋白表達可以因此導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏斜

11、高達22倍。然而，該實驗同 樣證明了在某些組織如骨和脂肪之間的p-actin表達存在同源性，也就是說， 在這些組織屮，可以將3-actin作為內(nèi)參蛋口使用，但也僅在這些特定的組織 中能夠使用。例如，魚類中實時熒光定量pcr (q rt-pcr)的研究與該研究的發(fā) 現(xiàn)相一致，該研究證明3-actin在心臟、肌肉和腦的某些組織中不是理想的加 樣對照，但其在腎臟和脾臟的表達結(jié)果一致，可作為內(nèi)參蛋白曲。此外，更進 一步的研究表明在不對稱組織中，b -actin等常作為加樣對照的內(nèi)參蛋白的表 達量也是不均一的。例如，在比較坐骨神經(jīng)近端到遠端部分時，相比z下，神經(jīng) 絲(nf-l)(神經(jīng)元細胞骨架的主要組分

12、)的表達明顯更高15,接近8倍，在 坐骨神經(jīng)的遠端部分達到4倍sem。因此 這些結(jié)果強調(diào)，即使對單個動物的相 同組織用于比較分析吋，解剖的準確性和一致性也是至關(guān)重要的。此外，有研究 證明內(nèi)參蛋口在不同組織或在暴露于感染因子后表達量也不同因此，根據(jù) 內(nèi)參蛋白定量產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。1.2總蛋白定量是一種測定蛋白上樣量的精確方法在選擇qwb內(nèi)參過程中需要考慮兒個重要的變量因素，包括敏感度的線性范圍、 不同組織或同一組織中蛋白質(zhì)的表達量差異等。為了確定qwb實驗中總蛋白分析 法是否是一種精確、可靠的檢測蛋白上樣量方法，有研究者用牛血清白蛋白 (bsa)經(jīng)梯度稀釋法建立了蛋口標準品，并以此評

13、估檢測靈皺度ill。bsa的相 對分子質(zhì)量為66 500,在該處可以檢測到線性熒光條帶，并且在很大的濃度范 圍內(nèi)都存在良好的線性關(guān)系，與其0. 998的變異系數(shù)一致。重要的是，bsa標準 品溶液有效證明了信號條帶的強弱很好地代表了蛋白質(zhì)上樣量的變化。這不僅證 明了使用該方法檢測蛋白質(zhì)的良好線性關(guān)系，也證明此方法中不存在通常岀現(xiàn) 于ecl蛋口檢測法屮的色彩飽和度問題。最終，當應(yīng)用licor odyssey定量掃描 系統(tǒng)檢測真正的生物樣品時，在很大的蛋白濃度范圍內(nèi)檢測蛋白質(zhì)上樣量時總 蛋白定量法(使用考馬斯亮藍)都有著優(yōu)于內(nèi)參蛋白3-actin和3-tubulin 的良好線性仃40ug) o bc

14、a法和總蛋白定量法的變異系數(shù)分別為0. 979和 0. 996,表明這2種方法都具有良好的線性。此外，在蛋h質(zhì)溶液上樣量的范圍 大至p40 mg時，總蛋口分析得出的數(shù)據(jù)仍與bca法所得出的數(shù)據(jù)具有非常直接 的相關(guān)性，進一步說明總蛋白定量是一個非?？煽康牡鞍踪|(zhì)上樣量對照。因此， 我們認為總蛋白定量提供了一種可避免單一蛋白對照所帶來的各種問題的測定 蛋白上樣量的方法?？偟鞍锥康膬?yōu)點如下：(1)在來自不同模型的不同組織中, 它是穩(wěn)定不變的；(2)在不同類型的組織中，它是穩(wěn)定的；(3)在同一組織的不 同部位屮，它是穩(wěn)定的?？偟翱诙渴莙wb屮一種簡單的技術(shù)，用來準確地確定 在凝膠內(nèi)是否已達到等同的蛋

15、白質(zhì)載量葩。通過總蛋白定量獲得的數(shù)據(jù)避免了 用內(nèi)參蛋白產(chǎn)生的誤差。這并不意味著看家基因不能用做上樣對照，在明確掌握 解剖結(jié)構(gòu)和內(nèi)參蛋白表達的情況下，可以引用內(nèi)參蛋白，但是相比之下，總蛋 白定量應(yīng)用的范圍和精確度更廣更好，因此，建議使用總蛋白定量以節(jié)省吋間、 資源，增加靈皺度和準確度，并且不必考慮將內(nèi)參蛋口作為上樣對照時的限制 問題。因此，總蛋白定量應(yīng)被作為現(xiàn)代熒光定量western印跡中數(shù)據(jù)標準化的替 代參考標準i171o2免染技術(shù)基本概念 2002年，analytical biochemistry上的一篇文章屮第一次提到免染技術(shù) (stain free)。免染技術(shù)主要包括2個部分，即免染膠和

16、chemi doc mp全能成 像系統(tǒng)，分析結(jié)果時需要image lab軟件。免染膠與普通的預(yù)制膠不同，免染膠 包含特有的免染技術(shù)，因此不能用預(yù)制膠代替。樣品制備及電泳步驟與普通電泳 一樣。電泳后，取出凝膠，置于chemi doc mp全能成像系統(tǒng)中。通過電泳分離 的蛋白經(jīng)特定波長的紫外線(uv)照射而激活，產(chǎn)生熒光，從而被ccd照相機 捕獲，廣2 min即能顯示總蛋白條帶，image lab軟件根據(jù)蛋白marker自動估算 各條帶的相對分子質(zhì)量和數(shù)量。2.1免染技術(shù)原理免染技術(shù)利用可以在預(yù)制膠內(nèi)使用的化學(xué)物質(zhì)，在凝膠制劑屮摻入三鹵代化合 物，當暴露uv輻射時，其催化三鹵代化合物和色氨酸殘基之

17、間的共價反應(yīng)。所 得的“活化的”蛋白質(zhì)在uv激發(fā)下發(fā)熒光，可以通過合適的成像系統(tǒng)在凝膠內(nèi) 或在轉(zhuǎn)移到印跡膜之后檢測18 o 2. 2免染技術(shù)的優(yōu)點免染技術(shù)為western印跡工作流程屮的數(shù)據(jù)標準化提供了一種新型的質(zhì)控工具 宜。免染法能夠檢測和校正實驗過程中的誤差。免染技術(shù)顯示出在整個western 印跡過程中的更多優(yōu)勢。通過免染法可在western印跡過程中提前檢測到相關(guān)嚴 重問題，并且在抗體孵育之前停止。能夠及時檢測到抗體孵育之前的凝膠性能和 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜情況，節(jié)省大量時間，并且避免之后的資源浪費。免染技術(shù)體現(xiàn)了現(xiàn) 有的基于染色法的總蛋白定量方法的優(yōu)勢，常見的tpn染色包括麗春紅染色液、 sy

18、pro ruby蛋白質(zhì)印跡免染和考馬斯亮藍r-350。de medina等報道19麗春紅 染液的線性范圍高達140 ug,但是其染色時間長，信噪比低，重復(fù)性差。 aldridge等檢測了 17sypro ruby卬跡染色對腦勻漿的稀釋樣品（每個泳道 2241 ng蛋白質(zhì)）的性能，發(fā)現(xiàn)染色在其特定工作濃度范圍內(nèi)呈線性。然而， sypro ruby染色需要不斷的時間消耗，并且更適用于各泳道大于50 u g的蛋白 上樣量owelinder和ekblad報道了迪在免疫檢測gapdh后用考馬斯亮藍r-350 作為總蛋白染色方法，它們通過sds-page從細胞裂解物中分離225 ug總蛋白， 證明了該染色

19、法在該范圍內(nèi)的線性。然而，它們的總蛋白染色方法僅限于pvdf 膜，因為考馬斯亮藍染色導(dǎo)致硝酸纖維素膜上非常高的背景。免染技術(shù)的另一個顯著優(yōu)點是快速顯現(xiàn)凝膠電泳分離蛋口質(zhì)和轉(zhuǎn)膜的能力。此外, 免染技術(shù)兼容硝酸纖維素膜和pvdf膜。免染技術(shù)以成像系統(tǒng)標準化和無偏差的 方式進行數(shù)據(jù)采集處理。數(shù)據(jù)標準化的傳統(tǒng)方法是基于各種hpk的表達水平一致 的認識之上，但目前利用免染技術(shù)進行總蛋白定量被認為是檢測細胞裂解物總 蛋白質(zhì)含量的良好代表。越來越清楚的是，hpk方法在其-般適用性方面受到限 制。任何蛋口質(zhì)作為標準化對照的第一個先決條件是證明在所研究的樣品屮穩(wěn)定 表達20。因此，合適的內(nèi)參蛋白選擇需要消耗一定

20、的時間去驗證及11。此外， 基于hkp的標準化需要對抗體稀釋、孵育時間和成像設(shè)置進行優(yōu)化。與免染技術(shù) 相比，這是一個非常漫長的過程，免染技術(shù)總蛋白定量的方法提供了精確的蛋 白質(zhì)上樣載量，而不需要長吋間的優(yōu)化完善。此外，hkp定量方法基于每個電泳 道的單個蛋口質(zhì)的比較，而免染技術(shù)的總蛋口質(zhì)定量方法利用了給定蛋口質(zhì)樣 甜中的所有信息。3蛋白樣品制備是實驗可信度的先決條件 蛋白樣品的制備可直接影響蛋白質(zhì)印跡上條帶的光密度，以下列出幾項蛋白樣 品制備時可能遇到的問題：（1）組織或細胞樣本的處理不當會導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品 降解和/或表達；（2）裂解緩沖液中清洗劑、鹽和蛋白酶抑制劑不足；（3） bca 試劑盒測

21、定蛋白濃度不準確。由于蛋白裂解物與污染物如細胞或組織碎片、脂肪、疏水蛋白聚集體、核酸和蛋 口酶的復(fù)雜性，可對western印跡結(jié)果產(chǎn)生直接和負而的影響，因此使用細胞 裂解緩沖液和勻漿技術(shù)消除其影響非常重要竺1。通常，含有非離子洗滌劑如 np-40和triton x-100的緩沖液比離子洗滌劑如sds和脫氧膽酸鈉產(chǎn)牛的刺激 更小。通常加入濃度為100150 mmol/l的鹽（如nacl或kc1）以防止蛋白質(zhì) 凝集。ripa 緩沖液1%np-4o 或 triton x-100, 1%脫氧膽酸鈉，0. 1%sds, 150 mmol/l na cl, 50 mmol/l tris-hcl （p h7

22、. 8） , 1 mmol/l edta和蛋口酶抑制 劑混合物用機械或手動儀器產(chǎn)生勻漿，這可以為western印跡結(jié)果的測定提供 可靠的數(shù)據(jù)。組織勻漿技術(shù)的正確選擇是western印跡測定成功的先決條件，并 且所采用的方法完全取決于樣品類型。其中一個方法是，對于細胞裂解，將沉淀 的細胞（在細胞懸浮液的情況下）加入冰冷（4°c）的ripa緩沖液或鋪板的細 胞中，將細胞洗滌后，將冰冷的ripa緩沖液直接加入板中，刮下并吸取細胞。 來自細胞或組織裂解物的勻漿的總蛋白濃度應(yīng)使用bca法測定。理想地，勻漿將 被稀釋至至少2 mg/m l的濃度，這將允許每個泳道1080 ug 1 mm厚的微型聚

23、 丙烯酰胺sds凝膠上樣。4結(jié)語蛋白質(zhì)卬跡分析是最廣泛使用的對目的蛋白質(zhì)進行半定量測定的方法之一。 western印跡實驗耗時長，包含許多操作步驟（如蛋白質(zhì)濃度測定、sds-page、 轉(zhuǎn)膜），會增加很多帶入誤差的幾率宜。為了準確比較蛋白質(zhì)印跡信號，必須 補償信號強度（與樣品本身無關(guān)），這種方法被稱為歸一化，并且在本領(lǐng)域屮 被廣泛運用。使用蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)的半定量通常涉及針對看家蛋白（如 3-actin）的標準化。為了校正可能存在的蛋白質(zhì)上樣的不準確性，一般都會增 加具有相對恒定表達的“看家蛋白”作為內(nèi)參載量對照。這些蛋白質(zhì)在許多不同 的樣品中含量豐富，并口它們的表達水平通常被認為對各種生理

24、條件和處理的 影響不皺感。2種最常用的內(nèi)參對照是p-actin和gapdi1。然而，幾個最近的報 告表明，以看家蛋白作為內(nèi)參對照須仔細評估。選擇hkp時應(yīng)當謹慎，因為不是 所有的hkp表達水平在實驗條件或不同樣品類型的變化下保持恒定，常用于數(shù) 據(jù)標準化的 hkp 包括 p-actin23> ptublin24和 gapdh25。tpn 利用加 載在給定泳道中的整個樣品的信號強度作為靶蛋白信號的加載對照。由于在各種 實驗條件下存在hkp表達變化的可能，通常建議使用多個hkp標準化western 印跡結(jié)果，從而增加實驗的時間和復(fù)雜性。相比之下，tpn的使用具有使單個蛋 白質(zhì)的表達變化的影響最

25、小化的優(yōu)點。最近，麗春紅染色和考馬斯亮藍染色己被 證明是作為上樣對照的管家基因的合適替代物。免染技術(shù)的總蛋白染色具有無須 染色或脫色步驟的優(yōu)點。使用免染技術(shù)作為p-actin或蛋白質(zhì)染色液的替代品 的評價顯示，基于免染法總蛋口定量的方法優(yōu)于3-actin等內(nèi)參蛋口，并且優(yōu) 于作為蛋白質(zhì)印跡上樣對照的麗春紅染色等染色方法。通過良好的樣品制備技術(shù)、檢測方法、軟件和分析的共同協(xié)作，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì) 印跡的準確密度計量分析，這些分析最終能夠產(chǎn)牛十分滿意的結(jié)果。為了獲得最 大程度的重復(fù)和完整性，強烈推薦運用基于免染技術(shù)的總蛋白定量方法，因為 這種方法為免疫印跡實驗過程屮數(shù)據(jù)的精確標準處理提供了新穎獨特的質(zhì)

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