發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、1會(huì)計(jì)學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究各種發(fā)酵過程變量發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究各種發(fā)酵過程變量在活細(xì)胞作用下的變化規(guī)律，以及各種在活細(xì)胞作用下的變化規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對(duì)這些變量變化速度的影響。發(fā)酵條件對(duì)這些變量變化速度的影響。 以化學(xué)熱力學(xué)（研究反應(yīng)的方向）和以化學(xué)熱力學(xué)（研究反應(yīng)的方向）和化學(xué)動(dòng)力學(xué)（研究反應(yīng)的速度）為基礎(chǔ)，化學(xué)動(dòng)力學(xué)（研究反應(yīng)的速度）為基礎(chǔ)，對(duì)發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的變化進(jìn)行描述。對(duì)發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的變化進(jìn)行描述。一、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的一、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容內(nèi)容第1頁/共39頁3研究內(nèi)容研究內(nèi)容微生物生長動(dòng)微生物生長動(dòng)力學(xué)力學(xué)基質(zhì)消耗動(dòng)力基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)學(xué)產(chǎn)物生成

2、動(dòng)力產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)學(xué)第2頁/共39頁4二、研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)二、研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的方法的方法 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的前提前提反應(yīng)器內(nèi)的攪拌系統(tǒng)能保證理想的混合；反應(yīng)器內(nèi)的攪拌系統(tǒng)能保證理想的混合；溫度、溫度、pHpH等環(huán)境條件能夠控制以保持穩(wěn)定；等環(huán)境條件能夠控制以保持穩(wěn)定；細(xì)胞有固有的化學(xué)組成，不隨發(fā)酵時(shí)間和某些細(xì)胞有固有的化學(xué)組成，不隨發(fā)酵時(shí)間和某些發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化；發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化；各種描述發(fā)酵動(dòng)態(tài)的變量對(duì)發(fā)酵條件變化的反各種描述發(fā)酵動(dòng)態(tài)的變量對(duì)發(fā)酵條件變化的反應(yīng)無明顯滯后。應(yīng)無明顯滯后。第3頁/共39頁51.1.宏觀處理法：宏觀處理法：把細(xì)胞看成一個(gè)均勻分把

3、細(xì)胞看成一個(gè)均勻分布的物體，不管微觀反應(yīng)機(jī)制，只考慮布的物體，不管微觀反應(yīng)機(jī)制，只考慮各個(gè)宏觀變量之間的關(guān)系，這樣便得出各個(gè)宏觀變量之間的關(guān)系，這樣便得出結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型2.2.質(zhì)量平衡法：質(zhì)量平衡法：根據(jù)質(zhì)量守恒定律，對(duì)根據(jù)質(zhì)量守恒定律，對(duì)某一物質(zhì)在過程發(fā)生前后的質(zhì)量變化進(jìn)某一物質(zhì)在過程發(fā)生前后的質(zhì)量變化進(jìn)行恒算。行恒算。 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究方法方法第4頁/共39頁6質(zhì)量平衡質(zhì)量平衡式式物質(zhì)在系統(tǒng)中積累的速度物質(zhì)在系統(tǒng)中積累的速度= =物質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)的速度物質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)的速度+ +物質(zhì)在系統(tǒng)中物質(zhì)在系統(tǒng)中生成的速度生成的速度- -物質(zhì)排出系統(tǒng)的速度物質(zhì)排出系統(tǒng)的

4、速度- -物物質(zhì)在系統(tǒng)中消耗的速度質(zhì)在系統(tǒng)中消耗的速度某物質(zhì)在系統(tǒng)中的含量能夠在線測量或估計(jì)，某物質(zhì)在系統(tǒng)中的含量能夠在線測量或估計(jì)，通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物質(zhì)在系統(tǒng)中變化的動(dòng)力學(xué)。質(zhì)在系統(tǒng)中變化的動(dòng)力學(xué)。人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)入或排出入或排出第5頁/共39頁7獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)多種理化參數(shù)尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)與微生尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)與微生物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關(guān)系物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關(guān)系建立多種數(shù)學(xué)模型，描

5、述多種理化參數(shù)隨建立多種數(shù)學(xué)模型，描述多種理化參數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系時(shí)間變化的關(guān)系利用計(jì)算機(jī)和程序控制，反復(fù)驗(yàn)證多種數(shù)利用計(jì)算機(jī)和程序控制，反復(fù)驗(yàn)證多種數(shù)學(xué)模型的可行性的適用范圍學(xué)模型的可行性的適用范圍第6頁/共39頁8氧需氧需求求好氧好氧發(fā)酵發(fā)酵兼性好氧兼性好氧發(fā)酵發(fā)酵厭氧厭氧發(fā)酵發(fā)酵液體表面發(fā)液體表面發(fā)酵酵液體深層發(fā)液體深層發(fā)酵酵深層發(fā)酵深層發(fā)酵操作方操作方法法分批分批發(fā)酵發(fā)酵分批補(bǔ)料分批補(bǔ)料發(fā)酵發(fā)酵連續(xù)連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究與微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究與發(fā)酵的種類、方式密切相關(guān)發(fā)酵的種類、方式密切相關(guān)第7頁/共39頁四、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究四、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的意義的意義 通過對(duì)發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)

6、力學(xué)的研究，進(jìn)行最佳發(fā)酵通過對(duì)發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究，進(jìn)行最佳發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、生產(chǎn)工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、基質(zhì)濃度、溫度、基質(zhì)濃度、溫度、pHpH值、溶解氧等工藝參數(shù)的值、溶解氧等工藝參數(shù)的控制方案，可以在這研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。控制方案，可以在這研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。 設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動(dòng)力設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型作為依據(jù)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序設(shè)計(jì)、學(xué)模型作為依據(jù)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序設(shè)計(jì)、模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從而使生產(chǎn)控制達(dá)到最優(yōu)化。而使生產(chǎn)控制達(dá)到最優(yōu)化。 發(fā)酵

7、動(dòng)力學(xué)的研究還在為試驗(yàn)工廠比擬放大、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究還在為試驗(yàn)工廠比擬放大、為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。第8頁/共39頁10 發(fā)酵過程中發(fā)酵過程中，基質(zhì)主要消耗在：主要消耗在：滿滿足菌體生長消耗維持微生物生存的消足菌體生長消耗維持微生物生存的消耗合成代謝產(chǎn)物的消耗耗合成代謝產(chǎn)物的消耗 PmGSSSSS S，基質(zhì)（底物）；，基質(zhì)（底物）；G G，菌體生長；菌體生長；MM，維持代謝；，維持代謝；P P，產(chǎn)物，產(chǎn)物合成合成1、幾個(gè)基本、幾個(gè)基本概念概念五、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型五、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型第9頁/共39頁Xt ddSmMs1111.1.維持因數(shù)維持因數(shù)(

8、m) (m) ：單位重量的（菌體）細(xì)單位重量的（菌體）細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持代謝消耗的基質(zhì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持代謝消耗的基質(zhì)的量。的量。 一般來講指維持細(xì)胞最低活性所需消一般來講指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的維持因數(shù)耗的能量。（碳，氮，氧等的維持因數(shù)mc,mn,momc,mn,mo）m ms:s:以基質(zhì)消耗以基質(zhì)消耗為基準(zhǔn)為基準(zhǔn) 的維持因的維持因數(shù)，數(shù)，X:X:菌體干重；菌體干重；S:S:基質(zhì)量基質(zhì)量t:t:發(fā)酵時(shí)間；發(fā)酵時(shí)間；M:M:表示維持。表示維持。第10頁/共39頁X1dtdsQs dtdsQ 12基質(zhì)的消耗速基質(zhì)的消耗速度度基質(zhì)的消耗比基質(zhì)的消耗比速率速率2.

9、2.比速（率）比速（率）: :單位時(shí)間內(nèi)，單位干菌體單位時(shí)間內(nèi)，單位干菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量 ( (消耗消耗的基質(zhì)用于維持代謝，菌體生長和產(chǎn)物的基質(zhì)用于維持代謝，菌體生長和產(chǎn)物合成合成) )。比速率是生物反應(yīng)中用于描述反比速率是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念應(yīng)速度的常用概念第11頁/共39頁X1dtdPQp X1dtdX 13菌體的比生長速菌體的比生長速率率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率第12頁/共39頁14)(YSXX/SGSX)(Ysg3.3.生長得率：菌體的生長量相對(duì)于基質(zhì)生長得率：菌體的生長量相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。消耗量的收得率。Y

10、X/s: 相對(duì)與基質(zhì)消耗的實(shí)際生長相對(duì)與基質(zhì)消耗的實(shí)際生長得率系數(shù)得率系數(shù)Yg/s: 相對(duì)于基質(zhì)消耗的（純生長）理相對(duì)于基質(zhì)消耗的（純生長）理論得率系數(shù)論得率系數(shù) 特定的基質(zhì)及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特特定的基質(zhì)及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特定微生物，它是一個(gè)常數(shù)，又稱最大生長得定微生物，它是一個(gè)常數(shù)，又稱最大生長得率或生長得率常數(shù)。率或生長得率常數(shù)。第13頁/共39頁154.4.產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對(duì)于基產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。質(zhì)消耗量的收得率。)(YSPP/SYP/s: 相對(duì)于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得相對(duì)于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得率系數(shù)率系數(shù)PSP)(YspYps: 相對(duì)于基質(zhì)消

11、耗的產(chǎn)物理論得率相對(duì)于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率系數(shù)系數(shù) 理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，對(duì)于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來對(duì)于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。同而異。第14頁/共39頁16第15頁/共39頁skssaxm17：菌體的生長比速：菌體的生長比速 s：單一限制性基質(zhì)：單一限制性基質(zhì)濃度濃度 Ks：半飽和常數(shù)：半飽和常數(shù)max: 最大比生長速最大比生長速率率s1.Monod方程方程式式2、微生物生長動(dòng)、微生物生長動(dòng)力學(xué)力學(xué) mmm/2m/2k ks

12、 s第16頁/共39頁18第17頁/共39頁19 Monod方程中單一限制性基質(zhì)可以是方程中單一限制性基質(zhì)可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關(guān)的營培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關(guān)的營養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對(duì)缺乏，就成為限制養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對(duì)缺乏，就成為限制性生長因子。實(shí)際過程中，可能出現(xiàn)多種性生長因子。實(shí)際過程中，可能出現(xiàn)多種限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了Monod方程的適用性。方程的適用性。第18頁/共39頁20u Ks ，微生物對(duì)基質(zhì)的飽和常數(shù)微生物對(duì)基質(zhì)的飽和常數(shù),當(dāng)當(dāng)= 1/2max，s= Ksu 當(dāng)當(dāng)s Ks，基質(zhì)濃度較高時(shí)，基質(zhì)濃度較高時(shí)，與與s無關(guān)，

13、零無關(guān)，零級(jí)反應(yīng)。級(jí)反應(yīng)。u 當(dāng)當(dāng)s趨近于無窮大時(shí)，趨近于無窮大時(shí)，=max.max是理論上是理論上最大的生長潛力。最大的生長潛力。mm/2kss第19頁/共39頁sksmmaxskssm 2100.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2Km米氏方米氏方程程mm/2kss莫諾方程莫諾方程sksVVmm 第20頁/共39頁22莫諾方程與米氏方程莫諾方程與米氏方程 二者形式相同，但微生物生長是細(xì)胞二者形式相同，但微生物生長是細(xì)胞群體生命活動(dòng)的綜合表現(xiàn)，機(jī)理非常復(fù)雜群體生命活動(dòng)的綜合表現(xiàn)，機(jī)理非常復(fù)雜。Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯(lián)系是：方程與米氏方程的區(qū)

14、別與聯(lián)系是：Monod方程是對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的總結(jié)，是經(jīng)驗(yàn)方程是對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的總結(jié)，是經(jīng)驗(yàn)方程（方程（empirical model）；）；米氏方程是根據(jù)酶反應(yīng)機(jī)理推導(dǎo)得出，是米氏方程是根據(jù)酶反應(yīng)機(jī)理推導(dǎo)得出，是機(jī)理方程（機(jī)理方程（mechanistic model）。）。第21頁/共39頁233、微生物的產(chǎn)物生成動(dòng)力、微生物的產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)學(xué)第22頁/共39頁24根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類進(jìn)行分類 Luedeking-Piret模型是一常見的分批發(fā)模型是一常見的分批發(fā)酵產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，它把產(chǎn)物生成酵產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，它把產(chǎn)物生成速率看作是菌體生長速率和

15、菌體濃度的速率看作是菌體生長速率和菌體濃度的函數(shù)，用數(shù)學(xué)式表示為：函數(shù)，用數(shù)學(xué)式表示為： 式中：式中：與生長偶聯(lián)的產(chǎn)物形成與生長偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù)系數(shù) 非生長偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù)非生長偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù) 第23頁/共39頁25偶聯(lián)型：偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長速率有緊密聯(lián)系，合成的產(chǎn)物通常速率有緊密聯(lián)系，合成的產(chǎn)物通常是分解代謝的直接產(chǎn)物，如葡萄糖是分解代謝的直接產(chǎn)物，如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成中間代謝物生成中間代謝物( (氨基酸或維生素氨基酸或維生素) )。這類初級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率與。這類初級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率與生長直接有關(guān)。式

16、生長直接有關(guān)。式中中00，0 0混合型：混合型：生長與產(chǎn)物生成相關(guān)生長與產(chǎn)物生成相關(guān)( (如如乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵) )，發(fā)酵產(chǎn)物生成速率可由，發(fā)酵產(chǎn)物生成速率可由Luedeking-PiretLuedeking-Piret模型數(shù)學(xué)式描述模型數(shù)學(xué)式描述，式中式中00，00。 該混合型模該混合型模型復(fù)雜的形成是將常數(shù)型復(fù)雜的形成是將常數(shù)、作為作為變數(shù)，它們?cè)诜峙l(fā)酵的四個(gè)時(shí)期變數(shù)，它們?cè)诜峙l(fā)酵的四個(gè)時(shí)期分別具有特定的數(shù)值。分別具有特定的數(shù)值。 根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類進(jìn)行分類 第24頁/共39頁26非生長偶聯(lián)型：非

17、生長偶聯(lián)型：在生長和產(chǎn)物無關(guān)在生長和產(chǎn)物無關(guān)聯(lián)的發(fā)酵模式中，細(xì)胞生長時(shí)，無聯(lián)的發(fā)酵模式中，細(xì)胞生長時(shí)，無產(chǎn)物，但細(xì)胞停止生長后，則有大產(chǎn)物，但細(xì)胞停止生長后，則有大量產(chǎn)物積累，產(chǎn)物的形成速率只與量產(chǎn)物積累，產(chǎn)物的形成速率只與細(xì)胞積累量有關(guān)。產(chǎn)物合成發(fā)生在細(xì)胞積累量有關(guān)。產(chǎn)物合成發(fā)生在細(xì)胞生長停止之后細(xì)胞生長停止之后( (即產(chǎn)生于次級(jí)生即產(chǎn)生于次級(jí)生長長) )，故習(xí)慣上把這類與生長無關(guān)聯(lián)，故習(xí)慣上把這類與生長無關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物，但不是的產(chǎn)物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物，但不是所有次級(jí)代謝產(chǎn)物一定是與生長無所有次級(jí)代謝產(chǎn)物一定是與生長無關(guān)聯(lián)的。大多數(shù)抗生素和微生物毒關(guān)聯(lián)的。大多數(shù)抗生素和微生物毒素的

18、發(fā)酵都是非生長偶聯(lián)的例子，素的發(fā)酵都是非生長偶聯(lián)的例子，非偶聯(lián)型發(fā)酵的生產(chǎn)速率只與已有非偶聯(lián)型發(fā)酵的生產(chǎn)速率只與已有的菌體量有關(guān)，而比生產(chǎn)速率的菌體量有關(guān)，而比生產(chǎn)速率為為一常數(shù)，與比生長速率一常數(shù)，與比生長速率沒有直接沒有直接關(guān)系。因此，其產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度高關(guān)系。因此，其產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度高低取決于細(xì)胞生長期結(jié)束時(shí)的生物低取決于細(xì)胞生長期結(jié)束時(shí)的生物量。量。式中式中0 0，00根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類進(jìn)行分類 第25頁/共39頁274、微生物的基質(zhì)消耗動(dòng)力、微生物的基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)學(xué)假設(shè)發(fā)酵過程沒有中間代謝產(chǎn)物積累，則含碳基質(zhì)的質(zhì)量平衡算式為：消耗的含碳基

19、質(zhì)消耗的含碳基質(zhì)=維持代謝消耗量維持代謝消耗量+菌體生長消耗量菌體生長消耗量+產(chǎn)產(chǎn)物合成消耗量物合成消耗量 即：第26頁/共39頁28微分后微分后：式中：式中：ms維持系數(shù)，即單位菌體、單位時(shí)間內(nèi)用 于菌體維持生命活動(dòng)的基質(zhì)量單純用于合成單位菌體所消耗的基質(zhì)量單純用于合成單位產(chǎn)物所消耗的基質(zhì)量上式反映了基質(zhì)消耗與菌體生長及產(chǎn)上式反映了基質(zhì)消耗與菌體生長及產(chǎn)物生成之間的關(guān)系。因此，當(dāng)生長動(dòng)物生成之間的關(guān)系。因此，當(dāng)生長動(dòng)力學(xué)模型和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型確定力學(xué)模型和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型確定后，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型即可確定。后，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型即可確定。第27頁/共39頁29六、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)六、發(fā)

20、酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)材實(shí)驗(yàn)材料料 菌種：菌種：雅致放射毛霉AS3.2778 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)） 試劑：試劑：DNS試劑2.實(shí)驗(yàn)步實(shí)驗(yàn)步驟驟 菌種斜面培養(yǎng)：菌種斜面培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面，將雅致放射毛霉接種于斜面上，25 培養(yǎng)48h。 種子培養(yǎng)：種子培養(yǎng)：斜面菌種在25恒溫培養(yǎng)48h 后，轉(zhuǎn)接于500mL 搖瓶，裝液量為150 mL，160 r/min 25 ，搖床培養(yǎng)16h為種液。第28頁/共39頁30 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng): 5 L 發(fā)酵罐中裝入3.5 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在在121 下滅菌30 min，

21、溫度降至30 時(shí)，接入種液，接種量為4%控制適宜的通氣比、保持罐壓為0.05 MPa、發(fā)酵溫度30 、攪拌速度160 r/min條件下發(fā)酵84h每12 h 取樣1 次進(jìn)行菌體生長量、還原糖產(chǎn)量、蔗糖糖消耗測定結(jié)果為3 次重復(fù)。3.分析方分析方法法 菌體生物量的測定菌體生物量的測定：采用比濁法，發(fā)酵液以蒸餾水稀釋，5000 r/min 離心10 min，除去上清液，菌體沉淀用生理鹽水洗2-3次再離心去上清液，用生理鹽水重懸并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定其OD600nm。第29頁/共39頁31 還原糖的測定：還原糖的測定：（1）在堿性條件下，還原糖與3、5二硝基水楊酸共熱，3、5二硝基水楊酸被還原為3氨基5

22、硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，可在722型分光光度計(jì)540nm波長測定棕紅色物質(zhì)的吸光度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，可求出發(fā)酵液中還原糖的含量。（2）取取4支干燥試管支干燥試管,編號(hào)編號(hào),按下表所示的量按下表所示的量,精確加入待精確加入待測液和試劑測液和試劑(ml):管號(hào)管號(hào)項(xiàng)目項(xiàng)目 空白空白 還原糖還原糖 0 0 1 1 2 2 3 3樣品量樣品量 0 0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0蒸餾水蒸餾水 3.5 3.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.53 3、5 5二硝二硝基基水

23、楊酸試劑水楊酸試劑 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5總體積總體積 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.05.0第30頁/共39頁32加完試劑后, 將各管搖勻，戴上小漏斗，在沸水浴中加熱5分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣泡。在540nm波長下，以0號(hào)管為空白，在分光光度計(jì)上測定出各管溶液的吸光度值。（3）以管1、2、3的吸光度值的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算樣品中還原糖的百分含量：還原糖第31頁/共39頁33 蔗糖測定：蔗糖測定：蔗糖經(jīng)6 mol/

24、L鹽酸水解轉(zhuǎn)化為還原糖，再按還原糖測定。水解前后還原糖的差值為蔗糖含量。根據(jù)實(shí)際情況選擇模型方程，由所測根據(jù)實(shí)際情況選擇模型方程，由所測得不同時(shí)間的菌體生長、基質(zhì)消耗量得不同時(shí)間的菌體生長、基質(zhì)消耗量和產(chǎn)物形成量畫出動(dòng)力學(xué)曲線和計(jì)算和產(chǎn)物形成量畫出動(dòng)力學(xué)曲線和計(jì)算出動(dòng)力學(xué)方程。出動(dòng)力學(xué)方程。第32頁/共39頁X1dtdPQp X1dtdX 34菌體的比生長速菌體的比生長速率率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率第33頁/共39頁354.4.產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對(duì)于基產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。質(zhì)消耗量的收得率。)(YSPP/SYP/s: 相對(duì)于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得相對(duì)于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得率系數(shù)率系數(shù)PSP)(YspYps: 相對(duì)于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率相對(duì)于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率系數(shù)系數(shù) 理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，對(duì)于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來對(duì)于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。同而異。第34頁/共39頁36u Ks ，微生物對(duì)基質(zhì)的飽和常數(shù)