乳酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝培訓(xùn)課程

1、魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院乳乳 酸酸 發(fā)發(fā) 酵酵 生生 產(chǎn)產(chǎn) 工工 藝藝Lactic acid Fermentation Production魯東大學(xué)生科院一一. 概述概述 Introduction生產(chǎn)方法：化學(xué)合成（10%）和發(fā)酵法（90%）廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥領(lǐng)域目前普遍使用DL-乳酸L-乳酸天然性，將是發(fā)展方向，特別應(yīng)用聚乳酸（可降解生物材料）廣泛存在于人、動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，旋光異構(gòu)體魯東大學(xué)生科院細(xì)菌乳酸途徑細(xì)菌乳酸途徑厭氧菌或微需氧菌，按發(fā)酵糖類(lèi)過(guò)程和產(chǎn)物不同，可分為厭氧菌或微需氧菌，按發(fā)酵糖類(lèi)過(guò)程和產(chǎn)物不同，可分為同型同型和和異型異型和和雙歧雙歧乳酸發(fā)酵乳酸發(fā)酵二二. 代謝途

2、徑及產(chǎn)乳酸微生物代謝途徑及產(chǎn)乳酸微生物1 乳酸代謝途徑乳酸代謝途徑同型乳酸發(fā)酵：它們利用糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸還原產(chǎn)生乳酸。發(fā)酵產(chǎn)物中主要為乳酸的稱(chēng)為同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵，如乳鏈球菌（Streptococcus Streptococcus lacticslactics）、乳酪鏈球菌（ Streptococcus Streptococcus cremoriscremoris）、干酪乳桿菌（lactobacillus lactobacillus caseicasei）、保加利亞乳桿菌（Lac. Lac. bulgaricusbulgaricus）等。魯東大學(xué)生科院 2H（乳酸脫氫酶）

3、 C6H12O6 EMP 2CH3COCOOH 2CH3CHOHCOOH 同型乳酸發(fā)酵的特點(diǎn)：1mol1mol的的G G產(chǎn)生產(chǎn)生2mol2mol乳酸，乳酸，理論轉(zhuǎn)化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。 同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵葡萄糖葡萄糖3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮2( 1,3-二二-磷酸甘油酸）磷酸甘油酸） 2乳酸乳酸 2丙酮酸丙酮酸同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵2NAD+ 2NADH4ATP4ADP2ATP 2ADPLactococcus lactisLactobacillus plantarum魯東大學(xué)生科院異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物中除乳酸外同時(shí)還有

4、比例較高的乙酸、乙醇、二氧化碳發(fā)酵產(chǎn)物中除乳酸外同時(shí)還有比例較高的乙酸、乙醇、二氧化碳等，稱(chēng)為異型乳酸發(fā)酵。其生物合成途徑有兩種。等，稱(chēng)為異型乳酸發(fā)酵。其生物合成途徑有兩種。a 6-6-磷酸葡萄糖酸途徑磷酸葡萄糖酸途徑通過(guò)該途徑，通過(guò)該途徑，1mol1mol的的G G產(chǎn)生產(chǎn)生1mol1mol的乳酸，乳酸對(duì)糖的理的乳酸，乳酸對(duì)糖的理論轉(zhuǎn)化率是論轉(zhuǎn)化率是50%50%。另外有比例較高的乙醇、乙酸和二氧。另外有比例較高的乙醇、乙酸和二氧化碳等?；嫉取?腸膜明串珠菌（腸膜明串珠菌（LeuconostocLeuconostoc mesenteroidesmesenteroides）及葡）及葡聚糖明串珠菌

5、（聚糖明串珠菌（LeuconostocLeuconostoc dextranicumdextranicum）通過(guò)該途）通過(guò)該途徑進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵。徑進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵。異型乳酸發(fā)酵：異型乳酸發(fā)酵：葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸葡萄糖葡萄糖6-磷酸葡磷酸葡萄糖酸萄糖酸5-磷酸磷酸木酮糖木酮糖3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛乳酸乳酸乙酰磷酸乙酰磷酸NAD+ NADHNAD+ NADHATP ADP乙醇乙醇 乙醛乙醛 乙酰乙酰CoA2ADP 2ATP-2H-CO2磷酸戊糖酮解途徑PK魯東大學(xué)生科院b b BifidusBifidus 途徑（雙歧途徑）途徑（雙歧途徑）雙歧桿菌（Bifidobacterium bifi

6、dum)進(jìn)行的乳酸發(fā)酵也是一條磷酸解酮酶途徑。該途徑的特點(diǎn)是：有兩個(gè)磷酸酮解酶參與；在沒(méi)有氧化作用和脫氫作用下，2分子G分解為3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接著，在3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶的參與下， 3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化為乳酸，轉(zhuǎn)化率為50%。磷酸己糖解酮途徑磷酸己糖解酮途徑HK 2葡萄糖葡萄糖 2葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸6-磷酸果糖磷酸果糖 6-磷酸磷酸-果糖果糖4-磷酸磷酸-赤蘚糖赤蘚糖 乙酰磷酸乙酰磷酸2木酮糖木酮糖-5-磷酸磷酸2甘油醛甘油醛 -3-磷酸磷酸 2乙酰磷酸乙酰磷酸2乳酸乳酸2乙酸乙酸乙酸磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶戊磷酸己糖解酮酶戊逆逆HMP途徑

7、途徑同同EMP乙酸激酶乙酸激酶雙歧發(fā)酵雙歧發(fā)酵魯東大學(xué)生科院特別提醒特別提醒：微生物的代謝途徑一般都不是單一的，不論同型乳酸發(fā)酵還是異型乳酸發(fā)酵，實(shí)際代謝產(chǎn)物都不象代謝途徑中那樣單純，兩類(lèi)乳酸發(fā)酵的代謝產(chǎn)物沒(méi)有不可逾越的界限。應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍：同型乳酸菌發(fā)酵的微生物已經(jīng)用來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。異型乳酸發(fā)酵的微生物，例如雙歧桿菌，已經(jīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)活菌飲料，魯東大學(xué)生科院米根霉乳酸途徑米根霉乳酸途徑好氧異型發(fā)酵，和細(xì)菌異型發(fā)酵不同，通過(guò)糖酵解途徑，副產(chǎn)物好氧異型發(fā)酵，和細(xì)菌異型發(fā)酵不同，通過(guò)糖酵解途徑，副產(chǎn)物有：乙醇、富馬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、醋酸有：乙醇、富馬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、醋酸乳酸對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為：乳

8、酸對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為：75%可以以淀粉為原料發(fā)酵可以以淀粉為原料發(fā)酵糖酵解成丙酮酸，存在三條途徑糖酵解成丙酮酸，存在三條途徑1 1）丙酮酸脫羧酶）丙酮酸脫羧酶-乙醇乙醇2 2）丙酮酸羧化酶）丙酮酸羧化酶-草酰乙酸（形成三羧酸循環(huán)副產(chǎn)物：富馬酸、草酰乙酸（形成三羧酸循環(huán)副產(chǎn)物：富馬酸、蘋(píng)果酸）蘋(píng)果酸）3 3）L-L-乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶-L-L-乳酸乳酸魯東大學(xué)生科院米根霉乳酸途徑米根霉乳酸途徑缺點(diǎn)缺點(diǎn)：提取過(guò)程中雜酸較難去除，：提取過(guò)程中雜酸較難去除，L-乳酸純度下降，嚴(yán)乳酸純度下降，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生白色沉淀重時(shí)產(chǎn)生白色沉淀優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：好氧條件下，合理控制營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件，可以為：好氧條件下，合理控制營(yíng)養(yǎng)和環(huán)

9、境條件，可以為同型乳酸發(fā)酵，糖轉(zhuǎn)化率接近細(xì)菌的同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵，糖轉(zhuǎn)化率接近細(xì)菌的同型乳酸發(fā)酵注意：微生物產(chǎn)乳酸的那種光學(xué)異構(gòu)體，由胞內(nèi)乳酸注意：微生物產(chǎn)乳酸的那種光學(xué)異構(gòu)體，由胞內(nèi)乳酸脫氫酶決定脫氫酶決定1 1）L-L-乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶2 2）D-D-乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶魯東大學(xué)生科院2 乳酸發(fā)酵微生物乳酸發(fā)酵微生物乳酸細(xì)菌乳酸細(xì)菌1）乳酸菌分離釀造發(fā)酸食品采樣泡菜形式富集碳酸鈣透明圈法分離（傾注法倒平板）2）產(chǎn)D-乳酸細(xì)菌德氏乳桿菌德氏乳桿菌：77g/L，轉(zhuǎn)化率90%，D-乳酸比例：90%保加利亞乳桿菌：40g/L，轉(zhuǎn)化率72%，D-乳酸比例：99%左旋乳酸芽孢桿菌菊糖芽孢乳桿

10、菌： 98g/L，轉(zhuǎn)化率97%，D-乳酸比例：99%魯東大學(xué)生科院2 乳酸發(fā)酵微生物乳酸發(fā)酵微生物乳酸細(xì)菌乳酸細(xì)菌3 3）產(chǎn)）產(chǎn)L-L-乳酸細(xì)菌乳酸細(xì)菌乳桿菌乳桿菌、鏈球菌、芽孢桿菌、鏈球菌、芽孢桿菌趨勢(shì)：嗜熱乳酸桿菌，厭氧高溫發(fā)酵（趨勢(shì)：嗜熱乳酸桿菌，厭氧高溫發(fā)酵（5050以上以上）部分微生物乳酸全部為部分微生物乳酸全部為L(zhǎng) L型，部分含少量型，部分含少量D-D-乳酸乳酸產(chǎn)乳酸細(xì)菌較多，根據(jù)需要選擇產(chǎn)乳酸細(xì)菌較多，根據(jù)需要選擇個(gè)別菌屬可產(chǎn)淀粉酶（嗜淀粉乳桿菌）個(gè)別菌屬可產(chǎn)淀粉酶（嗜淀粉乳桿菌）魯東大學(xué)生科院2 乳酸發(fā)酵微生物乳酸發(fā)酵微生物米根霉米根霉果園、菜園、花盆土壤中或谷物上分離果園、菜

11、園、花盆土壤中或谷物上分離馬?。R?。∕artinMartin）培養(yǎng)基分離純化）培養(yǎng)基分離純化最適溫度最適溫度3030，產(chǎn)酸多，副產(chǎn)物多，對(duì)糖利用效率低，但，產(chǎn)酸多，副產(chǎn)物多，對(duì)糖利用效率低，但可以以淀粉為原料（分泌淀粉酶、糖化酶）可以以淀粉為原料（分泌淀粉酶、糖化酶）魯東大學(xué)生科院三三. 乳酸生產(chǎn)工藝乳酸生產(chǎn)工藝1 原料及預(yù)處理原料及預(yù)處理碳源碳源1 1）蔗糖）蔗糖2 2）糖蜜）糖蜜3 3）葡萄糖）葡萄糖4 4）淀粉）淀粉輔料：輔料：麥根、麩皮、米糠、玉米漿、毛發(fā)水解液麥根、麩皮、米糠、玉米漿、毛發(fā)水解液魯東大學(xué)生科院2 發(fā)酵工藝發(fā)酵工藝細(xì)菌發(fā)酵工藝細(xì)菌發(fā)酵工藝1 1）菌種（德氏乳桿菌）菌種

12、（德氏乳桿菌）A）同型乳酸發(fā)酵的乳酸菌B）營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單C）耐高酸，反饋抑制作用小D）耐高溫，最好在50以上2 2）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)（種量5-10%）菌種成熟指標(biāo)：乳酸5-7g/L，細(xì)胞含量7-8*1010個(gè)/ml，鏡檢可以看到2-4個(gè)細(xì)胞排列成鏈，原生質(zhì)均勻，無(wú)大的異染顆粒，無(wú)雜菌魯東大學(xué)生科院2 發(fā)酵工藝發(fā)酵工藝細(xì)菌發(fā)酵工藝細(xì)菌發(fā)酵工藝培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方：還原糖 15%，麥根 3.75%，磷酸氫二銨 0.25%，碳酸鈣 10%種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)：50,24h，接種量 1-10%發(fā)酵操作發(fā)酵操作：填料系數(shù)0.8碳酸鈣分批添加，控制pH不低于5.0溫度： 50發(fā)酵罐敞口，利于二氧化碳逸

13、出殘?zhí)堑陀?g/L發(fā)酵結(jié)束周期：5-6d發(fā)酵結(jié)束，加石灰乳調(diào)pH10.0，提溫至90 ，澄清后進(jìn)入提取工段。魯東大學(xué)生科院米根霉發(fā)酵工藝米根霉發(fā)酵工藝斜面孢子：斜面孢子：30,4d30,4d種子培養(yǎng)基：葡萄糖種子培養(yǎng)基：葡萄糖 11%11%，尿素，尿素 0.2%0.2%，KHKH2 2POPO4 4 0.06% 0.06%，MgSO4 0.025%MgSO4 0.025%，ZnSO4 0.088%, CaCO3 1%,pHZnSO4 0.088%, CaCO3 1%,pH自然，自然， 34,24h34,24h發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 15%15%，尿素，尿素 0.2%0.2%，KH

14、2PO4 0.02%KH2PO4 0.02%，MgSO4 0.025%MgSO4 0.025%，ZnSO4 0.044%, CaCO3 6.7%(ZnSO4 0.044%, CaCO3 6.7%(單獨(dú)滅菌單獨(dú)滅菌),pH),pH自然，自然，34,32-34h34,32-34h發(fā)酵結(jié)束，氫氧化鈣中和至發(fā)酵結(jié)束，氫氧化鈣中和至pH7.0pH7.0，壓濾或離心去除菌體，壓濾或離心去除菌體魯東大學(xué)生科院3 提取工藝提取工藝發(fā)酵液發(fā)酵液-預(yù)處理（堿化）預(yù)處理（堿化）-提取提取-粗乳酸粗乳酸-精制精制-成品乳酸成品乳酸1）細(xì)菌發(fā)酵預(yù)處理發(fā)酵結(jié)束，5水合乳酸鈣，發(fā)酵液變粘，糖濃度高固化發(fā)酵結(jié)束升溫至90-1

15、00，加入石灰乳，pH調(diào)至9.5-10.0，靜置4-6h（維持溫度55 ），沉渣清液分離活性炭60-70 脫色，去除色素魯東大學(xué)生科院3 提取工藝提取工藝發(fā)酵液發(fā)酵液-預(yù)處理（堿化）預(yù)處理（堿化）-提取提取-粗乳酸粗乳酸-精制精制-成品乳酸成品乳酸2）米根霉發(fā)酵預(yù)處理發(fā)酵結(jié)束，氫氧化鈣中和pH至7.0,升溫至80-90 ，板框壓濾機(jī)過(guò)濾，去除菌體和過(guò)量碳酸鈣，濾餅熱水洗滌壓干濾餅，合并魯東大學(xué)生科院乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝濾液濾液-濃縮濃縮-冷卻結(jié)晶冷卻結(jié)晶-離心洗滌離心洗滌-加熱溶晶加熱溶晶-酸解（硫酸）酸解（硫酸）-過(guò)濾（去除硫酸鈣）過(guò)濾（去除硫酸鈣）-脫脫色（活性炭）色（活性炭）-粗乳酸粗乳酸

16、乳酸鈣常溫下溶解度：乳酸鈣常溫下溶解度：5%5%，水溶液，水溶液pH6.07.0pH6.07.0，乳酸鈣濃度達(dá)，乳酸鈣濃度達(dá)11141114波波美度可自然結(jié)晶美度可自然結(jié)晶1 1）濃縮：）濃縮：12-1312-13波美度（乳酸鈣波美度（乳酸鈣2628%2628%）雜質(zhì)影響（雜質(zhì)增加雜質(zhì)影響（雜質(zhì)增加1%1%，乳酸鈣溶解度增加，乳酸鈣溶解度增加10%10%），濃縮前要除雜），濃縮前要除雜魯東大學(xué)生科院乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝2 2）結(jié)晶）結(jié)晶初始溫度初始溫度30- 23 30- 23 （1h1h），投放），投放67%67%晶種晶種23 -18 23 -18 （1.5h1.5h）后溫度每后溫度每1h1h

17、降低降低2 2 終溫終溫10 10 ，保持，保持35h35h晶核形成：不能攪動(dòng)或震動(dòng)，否則會(huì)形成粥狀結(jié)晶，無(wú)法和母液分離晶核形成：不能攪動(dòng)或震動(dòng)，否則會(huì)形成粥狀結(jié)晶，無(wú)法和母液分離影響結(jié)晶因素：起晶誘導(dǎo)時(shí)間、晶核形成速度、晶體成長(zhǎng)速度影響結(jié)晶因素：起晶誘導(dǎo)時(shí)間、晶核形成速度、晶體成長(zhǎng)速度針形珊瑚狀結(jié)晶針形珊瑚狀結(jié)晶-精制原料精制原料球形珊瑚狀結(jié)晶球形珊瑚狀結(jié)晶-粗原料粗原料魯東大學(xué)生科院3 3）離心洗晶）離心洗晶晶體經(jīng)粉碎機(jī)打散成小顆粒晶體，甩慮離心機(jī)加水洗滌粘附在晶體上晶體經(jīng)粉碎機(jī)打散成小顆粒晶體，甩慮離心機(jī)加水洗滌粘附在晶體上的母液的母液乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝4 4）溶晶酸解）溶晶酸解乳酸鈣晶

18、體乳酸鈣晶體-溶解槽（通蒸汽升溫溶解）溶解槽（通蒸汽升溫溶解）-酸解槽（酸解槽（50%50%濃硫酸濃硫酸酸解）酸解）酸解時(shí)放熱，需冷卻使料溫不超酸解時(shí)放熱，需冷卻使料溫不超8080，防止乳酸鈣分解，防止乳酸鈣分解0.1%0.1%甲基紫檢測(cè)甲基紫檢測(cè)：合適，菊黃色；酸過(guò)量，綠色；乳酸鈣過(guò)量，紫色：合適，菊黃色；酸過(guò)量，綠色；乳酸鈣過(guò)量，紫色注意：控乳酸濃度不超控乳酸濃度不超22%22%，溫度，溫度80 80 內(nèi)，硫酸過(guò)量?jī)?nèi)，硫酸過(guò)量0.5%0.5%以下，溶液以下，溶液中石膏的過(guò)飽和系數(shù)為中石膏的過(guò)飽和系數(shù)為1.31.41.31.4，石膏晶體成熟，石膏晶體成熟1h1h魯東大學(xué)生科院乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝5 5）過(guò)濾脫色）過(guò)濾脫色0.5-3%0.5-3%粉末活性炭脫色粉末活性炭脫色30min30min，可得，可得20%20%左右濃度的乳酸溶液左右濃度的乳酸溶液注意：注意：乳酸鈣溶解度大，約乳酸鈣溶解度大，約