多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PPT

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段片段教材內(nèi)容教材內(nèi)容:基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識 (一一) PCR原理原理 (二二) PCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作操作提示操作提示結(jié)果分析與評價(jià)結(jié)果分析與評價(jià)課題延伸課題延伸練習(xí)練習(xí)一、課題目標(biāo)一、課題目標(biāo)n本課題通過本課題通過嘗試嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本本操作操作，使學(xué)生，使學(xué)生體驗(yàn)體驗(yàn)PCR這這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方方法法，理解理解PCR的的原理原理，討論討論P(yáng)CR的的應(yīng)用應(yīng)用 教材分析教材分析二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)n課題重點(diǎn)：課題重點(diǎn)：PCR的原理和的原理和

2、PCR的基本操作。的基本操作。n課題難點(diǎn)：課題難點(diǎn)：PCR的原理。的原理。教材分析教材分析三、課題背景分析三、課題背景分析n課題背景首先介紹了課題背景首先介紹了PCR是一種在體外迅速是一種在體外迅速擴(kuò)增擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，然后說明這一技術(shù)在片段的技術(shù)，然后說明這一技術(shù)在遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆等方面都有著廣泛的應(yīng)用，最后指出因克隆等方面都有著廣泛的應(yīng)用，最后指出本課題的目標(biāo)是了解本課題的目標(biāo)是了解PCR技術(shù)的基本原理，技術(shù)的基本原理，并嘗試用并嘗試用PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增DNA片段片段。教師在導(dǎo)。教師在導(dǎo)入本課題的學(xué)習(xí)時(shí)，可以先讓學(xué)生

3、談一談對入本課題的學(xué)習(xí)時(shí)，可以先讓學(xué)生談一談對PCR的認(rèn)識以及的認(rèn)識以及PCR的應(yīng)用，以激發(fā)學(xué)生的的應(yīng)用，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，然后再說明本課題的目標(biāo)。學(xué)習(xí)興趣，然后再說明本課題的目標(biāo)。教材分析教材分析四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)建議四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)建議n（一）（一）PCR原理原理n知識要點(diǎn)：知識要點(diǎn)：1.細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成復(fù)制的各種組成 成分與反應(yīng)條件；成分與反應(yīng)條件；2.DNA的合成方向；的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的應(yīng)用。聚合酶的應(yīng)用。教材分析教材分析（一）（一）PCR原理原理 教學(xué)建議：教學(xué)建議： n 理解理解PCR的原理，需要首先了解細(xì)胞內(nèi)參的原理，需要

4、首先了解細(xì)胞內(nèi)參與與DNA復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件。復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件。教師在教學(xué)過程中，可以首先引導(dǎo)學(xué)生回教師在教學(xué)過程中，可以首先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修憶必修2遺傳與進(jìn)化遺傳與進(jìn)化中的有關(guān)中的有關(guān)DNA復(fù)制復(fù)制的知識。在此基礎(chǔ)上，的知識。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生需要進(jìn)一步了學(xué)生需要進(jìn)一步了解解DNA雙鏈的方向，能夠區(qū)分雙鏈的方向，能夠區(qū)分DNA的的3端端和和5端端。此外，學(xué)生還需要了解。此外，學(xué)生還需要了解DNA聚合聚合酶的特性，如只能酶的特性，如只能從從DNA的的3端開始延伸端開始延伸DNA鏈、鏈、而不能從頭合成而不能從頭合成DNA等。等。教學(xué)建議教學(xué)建議（一）（一）PCR原理原理 教學(xué)

5、建議：教學(xué)建議：nTaq DNA聚合酶的應(yīng)用，解決了高聚合酶的應(yīng)用，解決了高溫導(dǎo)致溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促聚合酶失活的問題，促成了成了PCR技術(shù)的自動化，是一個(gè)重技術(shù)的自動化，是一個(gè)重要的知識點(diǎn)。教師可以結(jié)合專題要的知識點(diǎn)。教師可以結(jié)合專題2中中課題課題2“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)離與計(jì)數(shù)”Taq細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過程，細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過程，幫助學(xué)生加深理解。幫助學(xué)生加深理解。教學(xué)建議教學(xué)建議（二）（二）PCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程n知識要點(diǎn)：知識要點(diǎn)：PCR的基本步驟及每個(gè)步驟所發(fā)生的變化。的基本步驟及每個(gè)步驟所發(fā)生的變化。教材分析教材分析（二）（二）PCR的反應(yīng)過程

6、的反應(yīng)過程 教學(xué)建議：教學(xué)建議：n這部分內(nèi)容的教學(xué)應(yīng)以讀圖識圖為主。教這部分內(nèi)容的教學(xué)應(yīng)以讀圖識圖為主。教科書中圖科書中圖5-9“PCR反應(yīng)過程圖解反應(yīng)過程圖解”詳細(xì)地詳細(xì)地描繪了描繪了參與參與PCR的各組成成分的各組成成分；每一輪反；每一輪反應(yīng)的應(yīng)的三個(gè)基本步驟三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性、復(fù)性和延伸；每一輪中每一個(gè)步驟所發(fā)生的變化，即每一輪中每一個(gè)步驟所發(fā)生的變化，即每每個(gè)步驟所具有的作用個(gè)步驟所具有的作用。教師在教學(xué)中可以。教師在教學(xué)中可以請學(xué)生在讀圖的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文請學(xué)生在讀圖的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解字說明來加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的

7、地方時(shí)，教師要及時(shí)給予解答。的地方時(shí)，教師要及時(shí)給予解答。教學(xué)建議教學(xué)建議(一一) PCR原原理理n體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制:n模板模板DNAn原料原料: dNTPn酶酶: 解旋酶、解旋酶、DNA pol. n起始引物、合成方向起始引物、合成方向n合成環(huán)境合成環(huán)境nn解鏈解鏈模板變性模板變性n引物引物-起始起始引物引物-模板復(fù)性模板復(fù)性n子鏈延伸子鏈延伸子鏈延伸子鏈延伸(一一) PCR原理原理加樣器的使用加樣器的使用結(jié)果分析與評價(jià)結(jié)果分析與評價(jià)n此為紫外光吸收檢此為紫外光吸收檢測的結(jié)果檢驗(yàn)法，測的結(jié)果檢驗(yàn)法，實(shí)踐中很少用；實(shí)踐中很少用；普遍采用普遍采用瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠電泳法膠電泳法檢驗(yàn)檢驗(yàn)PC

8、R結(jié)果結(jié)果Fig. 7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeat多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 擴(kuò)增擴(kuò)增DNA片段片段 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?n了解了解PCR的基本原理，學(xué)的基本原理，學(xué)習(xí)習(xí)PCR的基本操作技術(shù)。的基本操作技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 n 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， 簡稱簡稱PCR）是體外酶促合成特異）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方片段的一種方法。典型的法。典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三步由高溫變性、低溫退火和

9、適溫延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其原理如下：將待擴(kuò)增的得以迅速擴(kuò)增。其原理如下：將待擴(kuò)增的DNA置置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；溫下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚聚合酶在合酶在72將單核苷酸從引物的將單核苷酸從引物的3端開始摻入，沿模端開始摻入，沿模板板53端方向延伸，合成端方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。反復(fù)進(jìn)行的新互補(bǔ)鏈。反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和延伸反應(yīng)循環(huán)，可使兩引物限定范圍這

10、種變性、退火和延伸反應(yīng)循環(huán)，可使兩引物限定范圍內(nèi)的內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。循環(huán)的次數(shù)主要取決序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個(gè)模板于模板的濃度，從理論上講一個(gè)模板DNA分子經(jīng)分子經(jīng)20次次循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)106。PCRPCR的基本原理的基本原理 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物一生二，二生四，四生萬物 PCR PCR三步曲三步曲變性變性 90909797退火退火 45456565延伸延伸 7272左右左右PCRPCR過程過程(二二) PCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程n變性變性-復(fù)性復(fù)性-延伸延伸n多重循環(huán)多重循環(huán)(

11、n)n模板以模板以2En擴(kuò)增擴(kuò)增短片段以指數(shù)式擴(kuò)增短片段以指數(shù)式擴(kuò)增長片段以線性式擴(kuò)增長片段以線性式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長度最終主產(chǎn)物片段長度在在P1-P2之間之間nPCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。它既可用于基因的分離、克隆和核苷域。它既可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突變體和重組體的酸序列分析，又可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控和研究、基因多態(tài)性構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控和研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制的探索及醫(yī)學(xué)鑒定等多方面，也被廣泛制的探索及醫(yī)學(xué)鑒定等多方面，也被廣泛運(yùn)用于

12、刑偵物證鑒定、親子鑒定及古分子運(yùn)用于刑偵物證鑒定、親子鑒定及古分子系統(tǒng)學(xué)研究等其他領(lǐng)域。系統(tǒng)學(xué)研究等其他領(lǐng)域。三、實(shí)驗(yàn)材料、器材及試劑三、實(shí)驗(yàn)材料、器材及試劑 n待擴(kuò)增的模板待擴(kuò)增的模板DNA ；nDNA熱循環(huán)儀，電泳儀，電泳槽，臺式離心機(jī)熱循環(huán)儀，電泳儀，電泳槽，臺式離心機(jī)，紫外檢測儀，紫外檢測儀，1.5ml離心管架，移液器，離心管架，移液器，1.5ml離心管，離心管，0.2ml離心管，槍頭等。離心管，槍頭等。 ndNTPs，Taq酶，引物一對，酶，引物一對，10PCR Reaction Buffer ，TdH2O PCR PCR反應(yīng)體系的五要素反應(yīng)體系的五要素： 引物、酶、引物、酶、dNT

13、PdNTP、模板和、模板和MgMg2+2+Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 來自水生棲熱菌來自水生棲熱菌 Thermus aquaticusThermus aquaticus 良好的耐熱性良好的耐熱性 MgMg2+2+依賴性依賴性 無校讀功能無校讀功能n 1.PCR反應(yīng)反應(yīng) nPCR反應(yīng)混合液的配制（反應(yīng)混合液的配制（n為反應(yīng)數(shù)）：為反應(yīng)數(shù)）： n n2.0l 反應(yīng)緩沖液（即反應(yīng)緩沖液（即10PCR 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 其中含其中含15mM MgCl2） n n2.0l dNTP(2mM,each) n n1.5l 引物引物F(2M) n n1.5l 引物引物R(2M) n n0.1

14、l Taq酶酶(5U/l) n 混勻混勻,取取19l分別加入分別加入n個(gè)個(gè)0.2ml PCR管中管中,各管加入各管加入模板模板DNA 1l, 輕輕用手摔一下輕輕用手摔一下. n無菌薄壁管中無菌薄壁管中順序加入順序加入反應(yīng)體系各成分反應(yīng)體系各成分: 雙雙/三蒸水三蒸水 l 10緩沖液緩沖液 2.5 l 25mmol/L Mg2+ 2.5 l 4 dNTP 2.0 l 50umol/L引物引物12.0 l 50umol/L引物引物22.0 l 模板模板DNA 1-2 lTaq DNA多聚酶多聚酶1.0 l 25.0 l輕彈管壁，使各成分充分混勻！輕彈管壁，使各成分充分混勻！ 實(shí)驗(yàn)操作（實(shí)驗(yàn)操作（1

15、）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)操作（實(shí)驗(yàn)操作（2）n設(shè)定循環(huán)程序設(shè)定循環(huán)程序:階一階一: 94943m 3m 階二階二: (949430s- 30s- 55 55 1m1m- - 72721m1m ) ) 25253535循環(huán)循環(huán)階三階三: 72725 510m10mPCR反應(yīng)在帶熱蓋的反應(yīng)在帶熱蓋的PCR儀上進(jìn)行儀上進(jìn)行,大約需要兩個(gè)半小時(shí)大約需要兩個(gè)半小時(shí).操作提示操作提示n1、一切器具均經(jīng)高壓滅菌、一切器具均經(jīng)高壓滅菌-烘干烘干-冷卻后使用；冷卻后使用；n2、各試劑小份分裝，、各試劑小份分裝，-20 保存，現(xiàn)用現(xiàn)??；保存，現(xiàn)用現(xiàn)??；n3、酶的取用不離開冰??；、

16、酶的取用不離開冰?。籲取液吸頭、離心管均取液吸頭、離心管均一次一次性性使用，及時(shí)更換；使用，及時(shí)更換；2.PCR產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測 n制備制備1.0%的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠 n取取5l PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測儀下觀察紫外檢測儀下觀察,記錄結(jié)果記錄結(jié)果.n電泳結(jié)果電泳結(jié)果有無目標(biāo)條帶出現(xiàn)有無目標(biāo)條帶出現(xiàn)，可判別，可判別+/-結(jié)果；結(jié)果；n根據(jù)條帶根據(jù)條帶寬度和亮度寬度和亮度，可直觀判斷擴(kuò)增產(chǎn)量；，可直觀判斷擴(kuò)增產(chǎn)量；n關(guān)于關(guān)于PCR假陰性、假陽性及非特異擴(kuò)增問題。假陰性、假陽性及非特異擴(kuò)增問題。電泳檢驗(yàn)電泳檢驗(yàn)PCR結(jié)果、分析與評價(jià)結(jié)果、分析與評價(jià)PCR

17、擴(kuò)增擴(kuò)增NGF基因（大鼠）基因（大鼠）rat beta-nerve growth factor sequence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggac

18、cc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3Perim 1: (5) gat cgg cgt aca ggc aga ac (3) 328-347Perim 2: (3) cgc ggg gtg aac gga gtc tc (5) 529-548 預(yù)期擴(kuò)增長度：預(yù)期擴(kuò)增長度：220bpDNA Marker NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp220bp PCR PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 一對引

19、物，分別與靶一對引物，分別與靶DNA5DNA5和和3 3端互補(bǔ)端互補(bǔ) 長度：長度：15153030個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸 引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無同源性引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無同源性引物的設(shè)計(jì)可以參照：引物的設(shè)計(jì)可以參照： 兩分鐘兩分鐘StepByStep學(xué)會引物設(shè)計(jì)軟件學(xué)會引物設(shè)計(jì)軟件 Primer premier5.0/oligo軟件軟件 核酸基因技術(shù)討論版核酸基因技術(shù)討論版/生物信息學(xué)討論版生物信息學(xué)討論版/ PCR技術(shù)討論版技術(shù)討論版引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)：1.長度在長度在15-30bp，GC含量在含量在45-55%之間。之間。 Tm=4(G+C

20、)+2(A+T)。2. 堿基分布表現(xiàn)出隨堿基分布表現(xiàn)出隨機(jī)機(jī)性，避免相同堿基連續(xù)性，避免相同堿基連續(xù) 排列。排列。3. 3不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級結(jié)構(gòu)。不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級結(jié)構(gòu)。4. 兩個(gè)引物各自的兩個(gè)引物各自的3不能互補(bǔ)，以免形成自身不能互補(bǔ)，以免形成自身 擴(kuò)增。擴(kuò)增。5. 引物必須經(jīng)引物必須經(jīng)GenBank查詢后，證實(shí)沒有與其他查詢后，證實(shí)沒有與其他 非目的非目的DNA高度互補(bǔ)，才能使用。高度互補(bǔ)，才能使用。PCRPCR的反應(yīng)特點(diǎn)的反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高：PCRPCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將加的，能將pg=10pg=10- 12- 12級的起始待測模板擴(kuò)增級的起始待測模板擴(kuò)