凝膠色譜柱操作

1、凝膠色譜柱操作1、 溶脹商品凝膠是干燥的顆粒，通常以4063um的使用最多。凝膠使用前需要在洗脫液中充分溶漲一至數(shù)天，如在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫到近沸，則溶漲時(shí)間可以縮短到12小時(shí)。凝膠的溶漲一定要完全，否則會(huì)導(dǎo)致色譜柱的不均勻。熱溶漲法還可以殺死凝膠中產(chǎn)生的細(xì)菌、脫掉凝膠中的氣泡。2、 裝柱由于凝膠的分離是靠篩分作用，所以凝膠的填充要求很高， 必須要使整個(gè)填充柱非常均勻，否則必須重填。凝膠在裝柱前，可用水浮選法去除凝膠中的單體、粉末及雜質(zhì)，并可用真空泵抽氣排出凝膠中的氣泡。最好購(gòu)買(mǎi)商品中的玻璃或有機(jī)玻璃的凝膠空柱，在柱的兩端皆有平整的篩網(wǎng)或篩板。將柱垂直固定，加入少量流動(dòng)相以排除柱中底端的

2、氣泡，在加入一些流動(dòng)相于柱中約1/4 的高度。柱頂部連接一個(gè)漏斗，頸直徑約為柱頸的一半，然后在攪拌下、緩慢的、均勻地、連續(xù)地加入已經(jīng)脫氣的凝膠懸浮液，同時(shí)打開(kāi)色譜柱的毛細(xì)管出口，維持適當(dāng)?shù)牧魉?，凝膠顆粒將逐層水平式上升，在柱中均勻地沉積，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用較小的濾紙片輕輕蓋住凝膠床的表面，再用大量洗脫劑將凝膠床洗滌一段時(shí)間。3、 柱均勻性檢查凝膠色譜的分離效果主要決定于色譜柱裝填得是否均勻，在對(duì)樣品進(jìn)行分離之前，對(duì)色譜柱必須進(jìn)行是否均勻的檢查。由于凝膠在色譜柱中是半透明的，檢查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光燈，用肉眼觀察柱內(nèi)是否有“紋路”或氣泡。也可向色譜柱內(nèi)加入有色大分子等

3、，加入物質(zhì)的分子量應(yīng)在凝膠柱的分離范圍，如果觀察到柱內(nèi)譜帶窄、均勻、平整，即說(shuō)明色譜柱性能良好；如果色帶出現(xiàn)不規(guī)則、雜亂、很寬時(shí)必須重新裝填凝膠柱。4、 上樣凝膠柱裝好后，一定要對(duì)柱用流動(dòng)相進(jìn)行很好的平衡處理，才能上樣。凝膠柱的上樣也是一個(gè)非常重要的因素，總的原則是要使樣品柱塞盡量的窄和平整。為了防止樣品中的一些沉淀物污染色譜柱，一般在上柱前將樣品過(guò)濾或離心。樣品溶液的濃度應(yīng)該盡可能的大一些，但如果樣品的溶解度與溫度有關(guān)時(shí)，必須將樣品適當(dāng)稀釋?zhuān)⑹箻悠窚囟扰c色譜柱的溫度一致。當(dāng)一切都準(zhǔn)備好后，這時(shí)可打開(kāi)色譜柱的活塞，讓流動(dòng)相與凝膠床剛好平行，關(guān)閉出口。 用滴管吸取樣品溶液沿柱壁輕輕地加入到色譜

4、柱中，打開(kāi)流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時(shí)，再次加入少量的洗脫劑沖洗管壁。重復(fù)上述操作及此 ，每一次的關(guān)鍵是既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠床面干燥而發(fā)生裂縫。隨后可慢慢地逐步加大洗脫劑的量進(jìn)行洗脫。整個(gè)過(guò)程一定要仔細(xì)，避免破壞凝膠柱的床層。5、 沖洗凝膠色譜的流動(dòng)相一半多采用水或緩沖溶液，少數(shù)采用水與一些極性有機(jī)溶劑的混合溶液，除此之外，還有個(gè)別比較特殊的流動(dòng)相系統(tǒng)，這要根據(jù)溶液分子的性質(zhì)來(lái)決定。加完樣品后，可將色譜床與洗脫液貯瓶及收集器相連，設(shè)置好一個(gè)適宜的流速，就可以定量地分布收集洗脫液。然后根據(jù)溶質(zhì)分子的性質(zhì)選擇光學(xué)、化學(xué)或生物學(xué)的方法進(jìn)行定性和定量

5、測(cè)定。6、 再生因?yàn)樵谀z色譜中凝膠與溶質(zhì)分子之間原則上不會(huì)發(fā)生任何作用，因此在一次分離后用流動(dòng)相稍加平衡就可以進(jìn)行下一次的色譜操作。但在實(shí)際應(yīng)用中常有一定的污染物污染凝膠。對(duì)已沉積于凝膠床表面的不溶物可把表層凝膠曲調(diào)，在適當(dāng)增補(bǔ)一些新的溶漲膠，并進(jìn)行重新平衡處理；如果整個(gè)柱有微量污染，0.5mo/llnacl 溶液洗脫。 在通常情況下，一根凝膠柱可使用半年之久。凝膠柱若經(jīng)多次使用后，其色澤改變，流速降低，表面有污漬等就要對(duì)凝膠進(jìn)行再生處理。凝膠的再生是指用恰當(dāng)?shù)姆椒ǔツz中的污染物，使其恢復(fù)其原來(lái)的性質(zhì)。交聯(lián)葡萄糖凝膠廠用溫?zé)岬?.5mol/l 氫氧化鈉和 0.5mol/l 的氯化鈉和混合

6、液浸泡， 用水沖洗到中性；而對(duì)于聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠由于遇酸堿不穩(wěn)定，則常用鹽溶液浸泡，然后用水沖到中性。7、 保存經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主，為了避免凝膠床染菌，可加少許氯仿、苯酚或硝基苯等化學(xué)物質(zhì)，它可以使色譜柱放置幾個(gè)月至一年。凝膠的干燥應(yīng)先對(duì)凝膠進(jìn)行浮選，除去細(xì)小的顆粒， 并用大量水洗， 除去鹽和污染物， 然后逐步增加一春濃度使凝膠收縮，在 6080度干燥，在整個(gè)操作過(guò)程中的蒸餾水、器皿和房間必須干凈。瓊脂糖凝膠的干燥操作比較麻煩，并且干燥后還不容易溶張，所以一般仍以濕態(tài)保存為主。凝膠色譜柱的使用方法看到很多蟲(chóng)友問(wèn)葡聚糖凝膠的使用方法，所以將自己的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)寫(xiě)下來(lái)，以作參考。葡聚糖凝

7、膠柱的使用方法大體有一下步驟：(1) 預(yù)處理稱(chēng)取葡聚糖凝膠（有不同型號(hào)）若干克，加入洗脫劑（通常為甲醇或者水，這里以甲醇為例）約20 倍凝膠量 ，置室溫下 3h 進(jìn)行溶脹，溶脹必須徹底，否則會(huì)使上柱后流速變慢，凝膠斷裂等。(2) 裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200 目尼龍布）墊底或購(gòu)買(mǎi)類(lèi)似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊緩緩連續(xù)裝入， 色譜柱的出口流速m 維持在510ml/min。(1d 為 0.05ml ，所以要 1s兩滴）膠顆粒沉積到柱底后關(guān)緊色譜柱，等沉降到 1-2cm時(shí)再 2 打開(kāi)色譜柱

8、。 直至降到滿意高度為止，等凝膠柱內(nèi)的液體留的與凝膠高度差不多時(shí)，用較小的濾紙蓋住凝膠床表面，再用洗脫劑洗脫過(guò)夜。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝。(3) 加樣裝好的色譜柱至少要用相當(dāng)于3 倍保留體積的洗脫劑平衡，待洗脫劑流至與凝膠柱液面相平時(shí) （不能流干，否則會(huì)帶入氣泡），用滴管吸取樣品溶液，在高于凝膠表面約1cm 處，沿管壁四周緩緩滴加樣品液，加完后打開(kāi)下面的出口，使樣品滲入凝膠內(nèi)。再關(guān)閉出口 ，用少量洗脫液將管壁殘留的樣品洗下，再打開(kāi)出口，至溶液滲入柱內(nèi)，再關(guān)閉出口。可以考慮再加一層薄薄的脫脂棉以保護(hù)柱表面（我一般不加），然后即可進(jìn)行洗脫。(4) 洗脫與收集洗脫時(shí)， 用甲醇作洗脫劑 ，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。一般酸性洗脫劑中堿性物質(zhì)容易洗脫，堿性洗脫劑中酸性物質(zhì)容易洗脫。多糖類(lèi)物質(zhì)等極性大的物質(zhì)考慮用水洗脫，常用的洗脫劑是水-甲醇，水 -乙醇，水 - 丙酮等，一般根據(jù)自己樣品的性質(zhì)選擇洗脫液，洗脫液可一直用單一梯度。凝膠