腹腔鏡檢查與rtｐcr在胃癌診療中的臨床意義

1、腹腔鏡檢查與rtpcr在胃癌診療中的臨床意義作者：張茂修，張光永，汪運(yùn)山，孫善會，劉楊【摘要】目的：探討進(jìn)展期胃癌術(shù)前腹腔鏡檢查與rtpcr檢測腹腔灌洗液中游 離癌細(xì)胞ceamrna的表達(dá)水平，在胃癌患者術(shù)后微轉(zhuǎn)移及預(yù)后的臨床駛。方法: 對52例進(jìn)展期胃癌患者術(shù)前行腹腔鏡探查，滅菌生理鹽水沖洗腹腔4一5次，收 集脫落細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查和rtpcr檢測c e amrna表達(dá)水平。結(jié)果：52例 胃癌患者中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測326 % ( 1 7 /52)陽性，rtp cr檢測5 5 8 % ( 29/52) c e amrna陽性表達(dá)，二者陽性率有顯著性差異(p< 005 )o結(jié)論： 診斷性

2、腹腔鏡檢查、rtpcr與plc有效結(jié)合，可提高腹腔轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)診斷的 靈敏性和特異性，有助于對胃癌分期、淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后的綜合判斷，對胃癌的輔 助治療提供依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】腹腔鏡；胃癌；游離癌細(xì)胞；rtpcrthe clinical significance of laparoscopy chol and rtpcr in gastric carcinoma diagnosis and therapyabstract 0bject ive:to evaluate ceamrna expression of peritoneal lavage fluid (plf)of patients wi th p

3、rogressive gastric cancer by laparoscopy and rtpcr before operation, we assess peritoneal metastasis09%ns about 4 5 times,and collected peritoneal free cells cytology and rt-pcrresults: the overall positive rate of 326%( 17/52), rtpcr positive rate was 558%(29/52); the rate of significantly higher t

4、han cytology findings (p &it;and prognosis after operation methods: before operation, we handled 52 patients with progressive gastric cancer by laparoscopy, washing abdominal cavity with detected by cytology was rtpcr was 005)conclusions: the efficient association of diagnostic lc、rtpcr and plc

5、(peritoneal lavage cytology)can help improving diagnostic specialty and sensitivity of peritoneal metastasis, synthetically analyzing the relation of stage classification, lymphnode metastasis and prognosis, in order to provide information for further adjuvant therapykey words laparoscopy; gastric c

6、arci no ma; free can cer cel is; rtpcr胃癌在我國的患病率和死亡率均居惡性腫瘤前列，手術(shù)是最有效的治療方法, 但半數(shù)以上的患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致手術(shù)失敗。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腹腔 游離癌細(xì)胞("ee cancer cells, fcc )在腹腔內(nèi)形成肉眼或h e染色均不能發(fā) 現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移灶是胃癌復(fù)發(fā)的重要原因。nakanishi等1 提出侵及漿膜層的腫 瘤細(xì)胞易于脫落的原因與腫瘤細(xì)胞缺乏cd44和|3 intergin粘附分子表達(dá)有關(guān)，ifccs在腹腔細(xì)胞刺激因子作用下，生物活性增高，侵及腹膜下組織形成微小轉(zhuǎn) 移灶，致術(shù)后轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。本研究首次運(yùn)用腹

7、腔鏡的微創(chuàng)傷性、rt pcr的特異性 和靈敏性檢測腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid, plf )中游離癌細(xì)胞及其 c e amrna表達(dá)水平，明確胃癌腹腔轉(zhuǎn)移形成機(jī)制，為胃癌的臨床診療提供依據(jù)。1材料與方法11試劑與設(shè)備rtpcr試劑、瓊脂糖、dna marker. depc水、taq酶購自上海生工；c e a ( pl5 ' gagcgaacctcaacctctcctgccact-3 ' p2 5'tgtagctgttgcaaatgctttaaggaagaagc 3 ' , 367bp)引物由上海博亞合成；t r i zol 試劑購自

8、invitrogin公司；腹腔鏡、離心機(jī)、5700pcr擴(kuò)增儀、超低溫冰箱、電 泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。12方法12 1細(xì)胞的收集2000年3月至2003年12月山東大學(xué)第二醫(yī)院行腹腔鏡探查的進(jìn)展期胃癌患 者5 2例，男42例平均(5 6 5 ±62)歲，女10例，平均(60±56)歲，在腹腔 鏡手術(shù)對腫瘤組織進(jìn)行侵入性操作前行腹腔灌洗，用42、300ml滅菌生理鹽水 沖洗胃床、腹腔等處，盡可能吸取沖洗液，加入edt a抗凝劑，3 0 0 0轉(zhuǎn)/ 分離心lomin,棄上清，部分脫落細(xì)胞固定he染色，由2位細(xì)胞學(xué)醫(yī)師盲法隨 機(jī)閱片，做出診斷。另部分沉淀脫落細(xì)胞迅速置于超低溫冰箱用

9、于mrna提取。12 2 總rna提取trizol體系提取總rna。提取的rna用01%depc水溶解，紫外分光光度儀 檢測rn a樣品的od 260nm/od280mn比值，得到rna濃度，然后置于-80°c保存 或立即檢測。123 r t p c rlug 總 rna、lul mmlv、7ul 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、lul antisense primer pl、 去rnase水補(bǔ)至20ul,快速離心混勻，37°clh, 95°c10min滅活mmlv,快速離心 使沉于底部。124 pcr反應(yīng)19ul pcr反應(yīng)體系、lul sense primer p2、58ul

10、超凈水,快速離心混勻, 快速離心均勻，95°c5min,快速離心,使沉于管底，加入2ul ( lu/ul ) taqdna 聚合酶，快速離心均勻，加入100ul液體石蠟。循環(huán)條件:94c lmin、58°c lmin、 72°clmin,循環(huán)35次,末次延長7min0 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖(含eb05mg/l)dna電泳。2結(jié)果52例各期進(jìn)展期胃癌患者中，經(jīng)腹腔鏡plc he染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測游離癌 細(xì)胞 326% (17/52)陽性;rtp c r檢測 55 8 % ( 29 / 52 ) ceamrna 陽性表達(dá)。 x 2檢驗(yàn)兩者檢測陽性率存在顯著性差異(

11、pc 0025 )。3 討論p l c檢查是一個(gè)有用的預(yù)測預(yù)后的因素，由于該法是檢測plf中fccs,故 敏感性較差。應(yīng)用plc檢測胃癌fccs的陽性率各家報(bào)道不一，診斷腹腔轉(zhuǎn)移的 特異性也存在差別，一般認(rèn)為fccs檢出率與胃癌漿膜浸潤的程度有關(guān)。abe 等2 在77個(gè)常規(guī)plc檢查陰性的胃癌中，14個(gè)(22% )出現(xiàn)腹腔復(fù)發(fā)，在 1 7個(gè)常規(guī)plc檢查陽性胃癌中，只有3個(gè)(18% )出現(xiàn)腹腔復(fù)發(fā)，故認(rèn)為常規(guī) plc檢查并不是一個(gè)預(yù)測腹腔復(fù)發(fā)的敏感指標(biāo)，其估計(jì)預(yù)后的價(jià)值也是有限的。 tokuda等3 應(yīng)用常規(guī)plc在136例胃癌患者中僅發(fā)現(xiàn)fccs陽性率為36%。plc或plc結(jié)合p l f中

12、腫瘤標(biāo)志物是預(yù)測胃癌腹腔復(fù)發(fā)的有效指標(biāo)，但是, 對plf中僅有的少量fccs而言無能為力，就需采用新的方法加以確認(rèn)，因?yàn)?上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性患者仍有部分出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。yonemura等4 應(yīng)用r t pcr技術(shù)測定了 p l f中mmp 7mrna表達(dá),結(jié)果可檢測到樣品中10個(gè)以下癌細(xì) 胞，而在間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、外周血和胃良性病變患者腹腔灌洗液中均未檢 測到mmp7mrna信號。該法預(yù)測腹腔腫瘤播散的敏感性為33%,結(jié)合plc檢查可 達(dá)62%。本組實(shí)驗(yàn)檢測的各期進(jìn)展期胃癌患者中，經(jīng)腹腔鏡plc he染色細(xì)胞形 態(tài)學(xué)檢測游離癌細(xì)胞326 % (17/52)陽性；rtpcr檢測558 % (

13、 2 9 /52 ) c e amrna陽性表達(dá)，與國外報(bào)道基本一致。fujii等5 應(yīng)用rt pcr和plc檢查了 86例胃癌plf中fccs,結(jié)果13個(gè)肉眼可見腹腔轉(zhuǎn)移的患者c e amrna 均陽性，而24個(gè)無漿膜浸潤的患者cea均陰性。在49個(gè)肉眼可見漿膜浸潤但無 腹腔轉(zhuǎn)移的患者中，常規(guī)pl c陽性率僅為12%,而rtpcr ceamrna陽性率達(dá) 55%,在cea陽性患者中，術(shù)后12個(gè)月內(nèi)腹腔復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為5 6 %, yonemura 等4 對230個(gè)胃癌plf中ceamrna的研究結(jié)果表明，plf中rtpcr ceamrna、 plc和el i sa法測定的cea水平的陽性率分別為

14、17%、19%和15%。plc 與淋巴結(jié)狀態(tài)、浸潤深度和靜脈浸潤有關(guān)，rtpcr c ea僅與腹腔復(fù)發(fā)相關(guān)，而 p l f中cea水平與腹腔復(fù)發(fā)無相關(guān)性。ceart p cr預(yù)測腹腔復(fù)發(fā)的敏感性和特 異性分別為31 %和9 5 %,準(zhǔn)確性達(dá)73%。結(jié)合plc檢查診斷腹腔復(fù)發(fā)的敏感性 可達(dá)57%。sakakura等6 應(yīng)用cea特異的rtpcr檢測了大網(wǎng)膜乳頭的胃癌微轉(zhuǎn)移， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于判別胃癌腹腔復(fù)發(fā)，檢測大網(wǎng)膜乳頭優(yōu)于plf。ueno等7和 kodera等8 應(yīng)用定量rtpcr檢測了胃癌plf和大網(wǎng)膜中的ceamrna表達(dá)水平, 結(jié)果應(yīng)用ceamrna診斷plf中fccs的敏感性和特異性分別

15、為77%和9 4 %,大網(wǎng) 膜中的敏感性和特異性分別為46%和90%。多因素分析顯示plf中ceamrna表達(dá) 水平是唯一危險(xiǎn)因子，因此認(rèn)為p l f中ceamrna表達(dá)水平可以敏感地預(yù)測胃 癌患者的腹腔復(fù)發(fā)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和漿膜浸潤有關(guān)，而p lc則不存在這種相 關(guān)性。tokuda等3 同法測定了 136例胃癌plf中ceamrna表達(dá)水平，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)該法的敏感性(221% )明顯高于細(xì)胞學(xué)檢查(36% ), ceamrna陽性患者的腹 腔復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者(p< 00001 )o rtpcr的陽性率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴 管浸潤、腫瘤浸潤深度和臨床分級的增加而提高。在plc陰性患者中

16、，cea陽 性患者的生存期明顯低于cea陰性患者(pv 0000 1 )。ribeiro等9 對49例進(jìn)展期胃癌患者進(jìn)行了術(shù)前腹腔鏡檢查，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)只有163%患者存在腹腔轉(zhuǎn)移，而應(yīng)用p l c檢查則發(fā)現(xiàn)41%患者存在卩：$。 在術(shù)中無肉眼可見的腹腔轉(zhuǎn)移患者中，29%患者存在ifccs,且ifccs只存在漿 膜浸潤3cm2或附近器官和結(jié)構(gòu)被浸潤的病例。結(jié)果提示，術(shù)前腹腔鏡檢查腹 腔轉(zhuǎn)移的效果是有限的，應(yīng)借助于腹腔鏡檢查的優(yōu)勢同時(shí)進(jìn)行plc等檢查方能提 高診斷ifccs的敏感性和特異性。plc已經(jīng)作為常規(guī)技術(shù)用于ifccs檢查，對僅有少量fccs的plf尚不能做出 陽性診斷，故其敏感性較差。因此

17、，應(yīng)用分子生物學(xué)方法rtpcr檢測fccs成為 研究熱點(diǎn)，盡管這些方法目前仍處于臨床研究階段,但已經(jīng)顯示出良好的應(yīng)用前 景。如果將快速的rtpcr技術(shù)、plc檢查與診斷性腹腔鏡檢查有效地結(jié)合使用， 不但能提高腹腔轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)診斷的敏感性和特異性，而且有助于對胃癌分期、淋巴 轉(zhuǎn)移和預(yù)后的綜合判斷，對胃癌的治療也有重要的指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)：1 nakanish;h,kodera y, toari i a, et a 1detect ion of carcinoembryonic antigenexpressing free tumor cells in peritoneal washes from p

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