鋅指蛋白的設(shè)計(jì)與利用-文檔資料

1、1鋅指蛋白的設(shè)計(jì)鋅指蛋白的設(shè)計(jì)與利用與利用生物技術(shù)三班生物技術(shù)三班蔣新培蔣新培郵箱郵箱:2l摘要：人工設(shè)計(jì)的鋅指蛋白一般包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要采用對(duì)DNA序列特異識(shí)別結(jié)合的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，而功能結(jié)構(gòu)域常常采用某些轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域或某些酶的活性結(jié)構(gòu)域。這樣進(jìn)行設(shè)計(jì)的鋅指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相應(yīng)的功能，這對(duì)于目的基因的表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)與核酸的相互作用研究提供了新的思路。3主要內(nèi)容主要內(nèi)容v鋅指結(jié)構(gòu)v鋅指的設(shè)計(jì)篩選v多鋅指之間連接區(qū)的設(shè)計(jì)v人工鋅指蛋白的應(yīng)用v展望 具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模式，每個(gè)重復(fù)的“指”狀結(jié)構(gòu)約含23個(gè)氨

2、基酸殘基，鋅以4個(gè)配價(jià)鍵與4個(gè)半胱氨酸、或2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸相結(jié)合。 相隔特定距離的半胱氨酸結(jié)合鋅指，能與某些RNA/DNA結(jié)合。56鋅指結(jié)構(gòu)鋅指結(jié)構(gòu)v在在1989年年Lee等揭示鋅指立體結(jié)構(gòu)具有保守等揭示鋅指立體結(jié)構(gòu)具有保守型，每個(gè)鋅指均是由型，每個(gè)鋅指均是由1對(duì)反平行的對(duì)反平行的折疊和一折疊和一個(gè)個(gè)螺旋組成，每一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都形成獨(dú)立的螺旋組成，每一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都形成獨(dú)立的包含鋅原子的小結(jié)構(gòu)域包含鋅原子的小結(jié)構(gòu)域,它通過(guò)它通過(guò)2個(gè)保守的個(gè)保守的His和和2個(gè)個(gè)Cys螯合一個(gè)鋅因子螯合一個(gè)鋅因子,從而使結(jié)構(gòu)更加從而使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。穩(wěn)定。 v鋅指結(jié)構(gòu)的共同特征是通過(guò)肽鏈中鋅指結(jié)構(gòu)的共同特征是

3、通過(guò)肽鏈中氨基酸氨基酸殘殘基的特征集團(tuán)與基的特征集團(tuán)與Zn2+的結(jié)合來(lái)穩(wěn)定一種很短的結(jié)合來(lái)穩(wěn)定一種很短的，可自我折疊成的，可自我折疊成“手指手指”形狀的的形狀的的多肽多肽空空間構(gòu)型。間構(gòu)型。 789 9鋅指蛋白鋅指蛋白 2 21313個(gè)手指，各由個(gè)手指，各由2323氨基酸組成，并氨基酸組成，并由由7 78 8個(gè)氨基酸連接；與個(gè)氨基酸連接；與 DNADNA大溝結(jié)大溝結(jié)合并環(huán)繞合并環(huán)繞DNADNA分子，大溝與特異分子，大溝與特異DNADNA堿堿基互作?；プ鳌?鋅指蛋白大多都是與鋅指蛋白大多都是與基因表達(dá)基因表達(dá)的調(diào)控有的調(diào)控有關(guān)的功能蛋白。關(guān)的功能蛋白。1011 鋅指的設(shè)計(jì)篩選鋅指的設(shè)計(jì)篩選在鋅

4、指結(jié)構(gòu)中，只有-螺旋中的幾個(gè)氨基酸殘基對(duì)DNA的特異性識(shí)別有作用。因此通過(guò)構(gòu)建鋅指的噬菌體展示庫(kù)，從中可篩選與特定DNA序列有高特異性與高度和力的鋅指。Rebar和Choo就分別建立了鼠轉(zhuǎn)錄因子Zif268的第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)中-螺旋殘基的隨機(jī)肽展示庫(kù)4，5。，用隨機(jī)三聯(lián)體堿基進(jìn)行三輪篩選，得到了與不同三連體堿基對(duì)相應(yīng)結(jié)合的64個(gè)鋅指序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：-螺旋的三個(gè)主要位（-1、+3、+6位）和一個(gè)輔助位+2位與DNA的識(shí)別密切相關(guān)。12Zif268 Zif268是Milbrandt及Lim等分別于1987年克隆發(fā)現(xiàn)的.其包括一內(nèi)含子序列和兩個(gè)外顯子序列，基因全長(zhǎng)為3.8kb.Zif268編碼一分子質(zhì)

5、量為61ku的蛋白質(zhì)Zif268.131416 多鋅指之間連接區(qū)的設(shè)計(jì)多鋅指之間連接區(qū)的設(shè)計(jì)l（1）采用具有柔韌性的連接區(qū)，使鋅指對(duì)所結(jié)合DNA親和力與特異性有所提高。l（2）把天然轉(zhuǎn)錄因子的二聚化區(qū)域作為連接區(qū)。l總之設(shè)計(jì)多鋅指蛋白時(shí)應(yīng)考慮到鋅指之間的連接區(qū)，這對(duì)于鋅指蛋白對(duì)所結(jié)合DNA特異性與親和力是重要的。17人工鋅指蛋白的應(yīng)用 （1）人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制 （2）轉(zhuǎn)錄激活子 （3）人工限制性內(nèi)切酶 18人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制子 人工設(shè)計(jì)的鋅指蛋白可以通過(guò)以下方式抑制基因的轉(zhuǎn)錄： n（1）特異性的鋅指與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域相連形成的融合蛋白。n （2）設(shè)計(jì)靶向轉(zhuǎn)錄區(qū)域的鋅指蛋白，抑制轉(zhuǎn)錄的延伸； 19人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制子n（3）設(shè)計(jì)靶向轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的人工鋅指蛋白，阻斷或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配；n（4）靶向目的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子結(jié)合的區(qū)域設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。 20人工轉(zhuǎn)錄激活子主要通過(guò)以下兩種方式實(shí)現(xiàn)：（1）鋅指與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域連接形成融合蛋白，通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的裝配激活基因的轉(zhuǎn)錄。（2）通過(guò)與轉(zhuǎn)錄抑制子對(duì)基因上游結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。212222展望 C2H2型鋅指為DNA序列特異性鋅指蛋白的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)很好的框架，通過(guò)噬