基因功能研究常用方法（課堂PPT）

1、1 第九章第九章 基因功能研究常用方法基因功能研究常用方法 主講教師：熊偉主講教師：熊偉 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室2 弄清基因的生物學(xué)功能,才能明確基因在疾病發(fā)生中的具體作用、弄清疾病發(fā)生的分子機(jī)制。常用的基因功能研究技術(shù)包括：（1）DNA克隆技術(shù)克隆技術(shù)（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)和核轉(zhuǎn)移技術(shù)（動(dòng)物克?。┺D(zhuǎn)基因技術(shù)和核轉(zhuǎn)移技術(shù)（動(dòng)物克?。?）基因敲除技術(shù)）基因敲除技術(shù)（4）反義技術(shù)）反義技術(shù)（5）RNA干涉技術(shù)干涉技術(shù)3 第一節(jié)第一節(jié) DNA克隆技術(shù)克隆技術(shù)4克隆克隆(clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來(lái)自同一始祖的相同副本

2、或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化克隆化(cloning)，即即無(wú)性繁殖無(wú)性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆5技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）6DNA克隆克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我接合成一具有自我復(fù)制能力的復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化復(fù)制子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿

3、主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。分子。 也稱也稱基因克隆或重組基因克隆或重組DNA 。 7生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等酶工程、細(xì)胞工程等目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基

4、因工程，又稱又稱重組重組DNA工藝學(xué)工藝學(xué)。8（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶9重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶10（三）目的基因（三）目的基因 cDNA 基因組基因組DNA目的基因目的基因 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）11（四）基因載體（四）基因載體定義定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或?yàn)閿y帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖

5、或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA12克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。13載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 能自主復(fù)制；能自主復(fù)制； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體具

6、有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；的篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)（外源有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。141. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息遺傳信息, , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 15噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用基

7、因組克?。┫盗校ㄖ脫Q型，適用基因組克?。?. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列163. 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)17酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他其他18二、重組二、重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本

8、原理克隆基本過(guò)程克隆基本過(guò)程目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 19 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過(guò)過(guò) 程程目目 錄錄20（一）目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻墨@取1. 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)(genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)4

9、. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見(jiàn)第（見(jiàn)第22章）章） 21（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建若將外源基因連接到復(fù)制子(基因載體)上,外源DNA就可以作為復(fù)制子的一部分在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制.在基因克隆中基因載體的選擇與構(gòu)建是一項(xiàng)技術(shù)性很強(qiáng)的工作,直接影響到基因克隆的成敗.22（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接2

10、3受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌（從大腸桿菌（從大腸桿菌K-12改造）改造）限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 感染感染（四）重組（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌24（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等25重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟

11、載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開(kāi)環(huán)載體開(kāi)環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目目 錄錄26 第二節(jié)第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核轉(zhuǎn)移技術(shù)27轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)

12、物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物( (transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)282930 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物整體水平研究目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物整體水平研究目的基因的生物技術(shù)，特點(diǎn)是的生物技術(shù)，特點(diǎn)是“分子及其細(xì)胞水平分子及其細(xì)胞水平的操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)的操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”31 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過(guò)程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過(guò)程 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞 將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮中 對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行

13、鑒定32 轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法 DNA顯微注射法 克隆法 胚胎干細(xì)胞技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 精子載體法等各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，常用的是顯微注射和克隆法33 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定 Southern雜交 確定外源基因的整合以及整合的拷貝數(shù) RT-PCR 確定外源基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄水平 Western雜交 確定外源基因蛋白質(zhì)的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)PCR（熒光定量PCR）34 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用 （1）建立致病基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型 （2）動(dòng)植物新品種的培育 （3）各種基因工程產(chǎn)品的制備 （4）探討生殖細(xì)胞的基因治療方法35 36核轉(zhuǎn)移技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即即動(dòng)物整體克隆

14、技術(shù)動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物體細(xì)胞，將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆( (clone)。這樣的個(gè)體所攜帶的性狀僅來(lái)自一個(gè)這樣的個(gè)體所攜帶的性狀僅來(lái)自一個(gè)父親或母親個(gè)體父親或母親個(gè)體, ,為無(wú)性繁殖為無(wú)性繁殖. .19961996年年, ,克隆羊克隆羊”多莉多莉”的產(chǎn)生成為當(dāng)?shù)漠a(chǎn)生成為當(dāng)年分子生物學(xué)發(fā)展最重要的事件年分子生物學(xué)發(fā)展最重要的事件二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)37 克隆羊克隆羊“3839基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)也稱也稱基因靶向基因靶向( (gene targeting) )滅活，滅活，有

15、目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。第三節(jié)、基因剔除技術(shù)第三節(jié)、基因剔除技術(shù)40 基因剔除程序基因剔除程序 將滅活的基因放入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞),使這一滅活的基因通過(guò)同源重組取代原有目的基因,篩選到基因定點(diǎn)滅活的細(xì)胞后,通過(guò)顯微注射到小鼠囊胚. 細(xì)胞在小鼠囊胚參與胚胎的發(fā)育,最終形成嵌合體小鼠,由于一部分生殖細(xì)胞來(lái)源于ES細(xì)胞,通過(guò)小鼠培養(yǎng)可獲得純合子基因剔除小鼠.41 基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物疾病可遺傳的模型建立動(dòng)物疾病可遺傳的模型, ,探討疾病發(fā)生機(jī)探討疾病發(fā)生機(jī)制制 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模

16、型 進(jìn)行基因剔除以模擬基因失活進(jìn)行基因剔除以模擬基因失活. .單基因疾病模型單基因疾病模型: :地中海貧血地中海貧血, ,動(dòng)脈硬化動(dòng)脈硬化, ,老年癡呆等老年癡呆等 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型 多基因疾病模型多基因疾病模型: :腫瘤腫瘤, ,高血壓高血壓, ,糖尿病糖尿病42 第四節(jié)第四節(jié) 基因沉默技術(shù)基因沉默技術(shù)43基因沉默技術(shù)基因沉默技術(shù) 反義(antisen)技術(shù) RNA干涉(RNA Interference,RNAi)44反義技術(shù)反義技術(shù) 反義RNA是根據(jù)RNA序列合成的互補(bǔ)RNA,可分為三類:作用于核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA形成雙鏈;作用于非編碼區(qū);作用于啟動(dòng)子 反義D

17、NA在DNA或RNA水平上以至轉(zhuǎn)錄與翻譯,其穩(wěn)定性好,有廣泛藥用價(jià)值 核酶是具有酶活性的RNA,參與RNA加工與成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表達(dá)45RNA干涉干涉(RNAi) RNA干涉技術(shù)是利用體外合成的短雙鏈RNA(21-23nt) 抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù),是轉(zhuǎn)錄后基因失活的一種研究基因功能的有力工具 機(jī)制:46Dicer47siRNA48Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRP49Effector Step siRNA binding siRNA unwinding RISC activation5051

18、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)課程作業(yè)根據(jù)自身專業(yè)和研究方向，以RNAi技術(shù)在XXX領(lǐng)域的研究進(jìn)展為題目，寫(xiě)一篇小綜述。寫(xiě)作要求：1. 按照一般發(fā)表文獻(xiàn)的格式書(shū)寫(xiě)。2. 可查閱CNKI（中國(guó)知網(wǎng)）或Pubmed上相關(guān)文獻(xiàn)，不得抄襲！3. 字?jǐn)?shù)：3000字左右。4. 不得抄襲！不得抄襲！52論文格式 題目 摘要（Abstract) 200字以內(nèi) 正文前言正文問(wèn)題與展望參考文獻(xiàn) 10-15篇53 完成方式：手寫(xiě)稿或電子打印稿 完成日期：2012年12月15日前交到醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)樓B-312或者下周上課課堂上交。54疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of

19、 Disease Relative Genes第第 五五 節(jié)節(jié)55克隆疾病相關(guān)基因的策略克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺? (functional cloning) )（二）定位克?。ǘ┒ㄎ豢寺?positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate gene approaches )56定義定義 從對(duì)一種致病基因的功能的了從對(duì)一種致病基因的

20、功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺?yīng)用應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。較易得到部分純化的遺傳性疾病。57克隆方式克隆方式 利用特異性抗體篩選表達(dá)型利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)；文庫(kù)； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選探針，篩選cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。58（二）定位克?。ǘ┒ㄎ豢寺《x定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作

21、系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析遺傳學(xué)分析( (確定致病基因染色體定位確定致病基因染色體定位) )交換分析、連鎖不平衡分析交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析分子生物學(xué)分析染色體異常染色體異常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基因分析、基因文庫(kù)的篩選與基因克隆文庫(kù)的篩選與基因克隆59基因定位的基本方法 1.體細(xì)胞雜交法 p283 2.原位雜交和熒光原位雜交 3.連鎖分析60體細(xì)胞雜交: 細(xì)胞雜交又稱細(xì)胞融合,是將來(lái)源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞(雜種細(xì)胞). 大多數(shù)細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠的體細(xì)胞雜交,它的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中保留小鼠染色體而人染色體逐漸丟失 僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的細(xì)胞正是進(jìn)行基因連鎖分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色體上,就可找到某一基因座位61原位雜交和熒光原位雜交(FISH): 根據(jù)疾病基因所編碼蛋白質(zhì)的信息,將其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為探針從基因組DNA中釣取該蛋白質(zhì)量的編碼基因 如:用及珠蛋白基因的cDNA作探針,與各種不同的人/鼠雜種細(xì)胞進(jìn)行原位雜交,找出cDNA探針與人染色體DNA的同源互補(bǔ)關(guān)系,從而將及珠蛋白基因分別定位于第16號(hào)和第11號(hào)染色體上.62連