RT-PCR原理和實驗步驟(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上RT-PCR原理與實驗步驟 一、知識背景： 1、基因表達：DNA          RNA        Protein 單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因         104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白） 

2、60;      共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。 2、PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈式反應(yīng)。 在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步： A.變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B.退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。 C.延伸：在DNA聚合酶和d

3、NTPs及Mg2存在下，退火引物沿5   3方向延伸。 以上三步為一個循環(huán)，如此反復(fù)。 3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性： 1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈； 2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA； 3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA. 二、RT-PCR的準備：1.引物的設(shè)計及

4、其原則： 1) 引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計是否合理對于整個實驗有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2) 引物設(shè)計原則的把握引物設(shè)計原則包括 :a、引物長度:一般為1530bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。 b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機分布，避免嘌

5、呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。 c、 3 端要求：3 端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。 d、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。 e、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補，3端不應(yīng)超過2個。f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性

6、應(yīng)小于連續(xù)8個的互補堿基存在。 g、5端無嚴格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇適當?shù)囊?。常用引物設(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。 2、耗材：實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。 3、試劑準備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。 

7、三、RNA的提取方法RTPCR中從細胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。  RNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗原理和步驟來源：生物谷 訪問量：3688分享一、實驗?zāi)康恼莆罩参锟俁NA非變性膠電泳的原理和

8、方法。二、實驗原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%-1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子量時，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。三、實驗材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，0.5g/ml溴化乙錠（EB）10X載樣緩沖液。四、實驗步驟（1）用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×

9、TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。（2）在超凈工作臺上，用移液器吸取總RNA樣品4l于封口膜上。在實驗臺上再加入5l 1×TAE電泳緩沖液及1l 的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。（3）打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V，使RNA由負極向正極電泳，約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結(jié)果。RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測試劑：（1）MOPS緩沖液（10*）:0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。（2）上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍，0.4%二甲苯藍。（3）甲醛。（4）去離子甲酰胺。v電泳槽清洗：去污劑洗干凈（一般浸泡過夜）水沖洗乙醇干燥3%H2O2灌滿室溫放置10分鐘0.1%DEPC水沖洗。操作：（1） 將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍，晾干備用。（2） 配制瓊脂糖凝膠。稱取0.5g瓊脂糖，置干凈的100ml 錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。待膠涼至60-70 ，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩沖液和0.5ul 溴化乙錠，混合均勻。灌制瓊脂糖凝膠。（3） 樣品準備： 取 DEPC處理過的500ul小離心管，依次加入如下試劑： 10x MOPS緩沖