芯片在皮膚研討中的實(shí)用性

1、芯片在皮膚研討中的實(shí)用性QPCR芯片基本原理及相關(guān)應(yīng)用每張 QPCR芯片如同上百個(gè) QPCR微反應(yīng)池的集成 , 每個(gè)微反應(yīng)池都固定有基因特異性引物 , 當(dāng)加入含有模板和熒光基團(tuán)的 QPCR反應(yīng)體系后 , 在相同的反應(yīng)條件下 , 不同的基因都能同時(shí)進(jìn)行特異性擴(kuò)增 , 每個(gè)微反應(yīng)池的位置信息就代表了某個(gè)特定基因 , 利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)微反應(yīng)池中 PCR反應(yīng)的過程 , 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就能同時(shí)對(duì)上百個(gè)基因 mRNA或 cDNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。與基因芯片相比 ,QPCR芯片的通量顯著減低 , 一次至多檢測(cè) 96 個(gè)或 384 個(gè)基因 ,基本相當(dāng)于基因芯片通量的 1%,但是 QPCR芯片的

2、擴(kuò)增對(duì)象經(jīng)過仔細(xì)選擇 , 是某一組織或病變類型高度相關(guān)的基因 , 更便于數(shù)據(jù)的分析處理 , 檢測(cè)基因還可以隨研究需要加以改動(dòng) , 便于操作 , 而且價(jià)格比較低廉?；蛐酒?QPCR芯片的原理不同 , 但對(duì)于基因表達(dá)譜而言 , 他們的檢測(cè)對(duì)象 (mRNA或 cDNA)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ( 表達(dá)豐度 ),QPCR與基因表達(dá)芯片都高度一致 , 許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段 , 而對(duì)于幾十個(gè)甚至幾百個(gè)基因的表達(dá)豐度檢測(cè) ,QPCR技術(shù)完全可以取代基因芯片?；蛐酒ㄟ^對(duì)來源于不同個(gè)體 ( 正常與患者 ) 、不同組織或不同發(fā)育階段組織細(xì)胞內(nèi)的 mRNA(經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的 cDNA)進(jìn)行檢測(cè) ,

3、 可以對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性等進(jìn)行綜合的分析與判斷 , 迅速將某個(gè)或幾個(gè)基因與病變起來 , 也為進(jìn)一步研究基因間相互作用關(guān)系提供參考。那么中等通量的 QPCR技術(shù)是否能夠解決同樣的問題呢 ?答案是肯定的。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)是將基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)與分子信號(hào)過程進(jìn)行的關(guān)鍵步驟。 目前廣泛運(yùn)用的軟件是根據(jù)基因表達(dá)量的變化 , 計(jì)算機(jī)結(jié)合已知信號(hào)通路的信息 , 將“宏觀表型”與分子信號(hào)過程結(jié)合。由于這一軟件預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)是已知信號(hào)過程 , 并不能預(yù)測(cè)新的未知信號(hào)過程 , 所以對(duì)基因芯片的海量數(shù)據(jù)的利用率有限。 而在 QPCR芯片的設(shè)計(jì)過程中 , 研究者依據(jù)已知的信號(hào)過程選擇檢測(cè)對(duì)象

4、 , 盡管選擇的基因總數(shù)不多 ,但可能都是預(yù)測(cè)軟件的參考基因 , 同樣會(huì)得到較好的結(jié)果。在當(dāng)今生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 ,QPCR作為一種新型實(shí)用研究工具得到了越來越高度的重視 , 其使用量逐年上升 , 但是 QPCR芯片技術(shù)的應(yīng)用才剛剛處于起步階段。 有關(guān)學(xué)者開始利用 QPCR 芯片技術(shù)進(jìn)行多領(lǐng)域醫(yī)學(xué)研究 , 取得了有突破性意義的成果。 , 等認(rèn)為雌激素天然衍生物 2- 甲基雌二醇作為 (2-me-thoxyestradiol,2ME), 在臨床試驗(yàn)中是乳腺癌一個(gè)重要的評(píng)價(jià)對(duì)象。他們?cè)趦煞N治療組中通過 QPCR芯片技術(shù)測(cè)試鑒定了 Dox 細(xì)胞毒性單獨(dú)處理和協(xié)同 2ME處理后細(xì)胞的基因表達(dá)差異。 其

5、研究主要目標(biāo)是評(píng)估 2- 甲基雌二醇在對(duì)阿霉素多耐藥性乳腺癌細(xì)胞 (MCF-7/Dox) 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)影響及其潛在的作用機(jī)理。 IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco 等認(rèn)為IL-12RB2 在人類 B 細(xì)胞惡性腫瘤中是最為腫瘤抑制基因存在作用的。大鼠 IL-12基因敲出后自然產(chǎn)生了 B 細(xì)胞惡性腫瘤 , 而且有了肺上皮細(xì)胞腫瘤。但是 IL-12 沒有能力對(duì)表達(dá) IL-12 受體的 B16 黑色素瘤細(xì)胞有直接作用。他們利用 QPCR芯片對(duì)大鼠 IL-12 基因正常組和敲出組進(jìn)行測(cè)試 , 發(fā)現(xiàn) IL-12 能通過抑制血管生成來降低表達(dá) IL-12 受體的 B16

6、細(xì)胞的致瘤性。 AndreasHald,BirgitteRono 等認(rèn)為除了在宿主防御方面表現(xiàn)明顯的重要性 , 巨噬細(xì)胞已經(jīng)被證明在不同的病態(tài)條件 , 包括慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥中扮演一個(gè)有害的作用。而巨噬細(xì)胞活化和遷移與細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。這個(gè)過程可以通過多個(gè)蛋白水解酶完成。在這項(xiàng)研究中 , 他們利用 QPCR芯片進(jìn)行分析 , 發(fā)現(xiàn) LPS誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá) , 同時(shí)降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)。 此外 , 基因間的比較的表達(dá)水平相關(guān)的蛋白酶透露他們之間存在較大的差異基因表達(dá)水平 , 凸顯了巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。 除了這些文章還有學(xué)者分別對(duì)病原微生物檢測(cè)、 炎癥反

7、應(yīng)研究11 等方面進(jìn)了相關(guān)研究 , 得到了很好的研究成果。QPCR芯片在皮膚科學(xué)中的應(yīng)用前景在皮膚科學(xué)研究中 , 被毛突變小鼠都是用來研究人類同源基因疾病良好的動(dòng)物模型。國內(nèi)外研究者已獲得了 20 多個(gè)被毛突變系小鼠 , 如在皮膚、免疫及腫瘤領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用的裸小鼠 12; 表皮病變引起被毛異常的 hr 小鼠和 ic 小鼠 13; 章金濤等的豫醫(yī)無毛小鼠 14; 李善如等發(fā)現(xiàn)的被毛突變無毛小鼠 15 等等。通常認(rèn)為毛發(fā)多少與毛囊數(shù)量及毛囊發(fā)育周期相關(guān) , 許多研究集中在毛囊本身及毛囊與皮膚微環(huán)境信號(hào)分子的相互關(guān)系上 , 如 hid 和 sa 等基因直接作用于毛球 , 引起毛發(fā)發(fā)育障礙 16,

8、而經(jīng)過皮膚病理學(xué)家 JohnSundberg 博士的鑒定 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠皮膚的主要病變是過度角化 , 導(dǎo)致毛發(fā)生長困難 , 毛囊的數(shù)目并未顯著減少、主要形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。因此 ,snthr-1Bao 小鼠和 hr 等小鼠一樣 , 是表皮角化、毛發(fā)阻生、皮膚慢性損傷并發(fā)無菌性炎癥的理想模型。僅從組織病理學(xué)來看 ,snthr-1Bao 稀毛突變小鼠皮膚的原發(fā)病變與人類 Alagile 綜合癥比較相似。 Alagile 綜合癥為常染色體隱性遺傳性疾病 , 臨床表現(xiàn)為頭皮斑禿和全身廣泛毛發(fā)稀少 , 性腺功能減退 , 身材發(fā)育延遲等 ; 病組織理表現(xiàn)為表皮輕度棘皮病樣改變 , 角化過度

9、而深入毛孔形成角栓 , 但目前該病分子機(jī)制尚未完全清楚 17, 需要開發(fā)出相應(yīng)的模型進(jìn)行分子水平上的研究?！捌つw表達(dá)關(guān)鍵基因 QPCR芯片”可以為這方面的研究提供了一種新的嘗試。 從 QPCR芯片開發(fā)的角度 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠也是待開發(fā)的“皮膚表達(dá)關(guān)鍵基因 QPCR芯片”很好的試驗(yàn)對(duì)象 , 可以為芯片的設(shè)計(jì)、優(yōu)化及將來的推廣應(yīng)用提供了最直接的檢驗(yàn)。再例如在皮膚科學(xué)中 , 瘢痕疙瘩是在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細(xì)胞過度增殖和膠原過度分泌所致的病理性瘢痕 , 目前尚無確切有效的藥物。眾多學(xué)者通過大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床證據(jù)表明 , 瘢痕疙瘩的發(fā)生機(jī)理與多個(gè)基因的功能活動(dòng)密切相關(guān)。 Smi

10、thJC,BooneBE,OpalenikSR18 等通過使用 QPCR研究發(fā)現(xiàn)降低 Wnt 信號(hào)表達(dá)的多種抑制因素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表面這個(gè)基因的作用。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中的誘餌受體 IL-13R 2 是低表達(dá) , 在瘢痕疙瘩中幾乎不存在。得到QRT-PCR證實(shí)的有用結(jié)論是 , 支持在瘢痕疙瘩治療中提高 IL-13 的活性。 Chang等 .(20XX)19 通過研究發(fā)現(xiàn) HOX基因在發(fā)育的胚胎階段有重要作用 , 能夠調(diào)節(jié)人的分化細(xì)胞 , 包括人類的真皮纖維母細(xì)胞 , 不同的 HOX基因表達(dá)可能成為組成瘢痕疙瘩的惡性表型。 魏斌 , 范金財(cái)?shù)?20 運(yùn)用 RNAi 干擾正常皮膚成纖維細(xì)胞前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 2(PTGS2)基因的表達(dá) , 利用 realtimeRT-PCR 驗(yàn)證 siRNA沉默效果 ; 應(yīng)用全基因組芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜變化。 檢測(cè)到與 PTGS2基因相關(guān)的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同發(fā)揮作用的相關(guān)基因 , 證明 PTGS2與瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系 , 為治療瘢痕疙瘩提供了一個(gè)潛在的候選靶點(diǎn)。BockO,YuH,ZitronS21 研究了 beta1-3 和它們的受體 IandII 對(duì)皮膚纖維原細(xì)胞的影響。其他的一些基因 , 包括 IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色體臂