親水作用色譜

1、親水作用色譜（HILIC ）在體內(nèi)藥物分析中的研究進(jìn)展姓名:李沙沙學(xué)號(hào):201212282939專業(yè)： 藥劑導(dǎo)師 趙永星親水作用色譜（HILIC ）在體內(nèi)藥物分析中的研究進(jìn)展摘 要近年來親水作用色譜（HILIC ）成為色譜領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。親水作 用色譜是一種結(jié)合親水固定相與極性有機(jī)溶劑 -水體系流動(dòng)相的色譜分離技術(shù)， 對(duì)反相作用色譜中難以保留的極性化合物能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離。本文簡(jiǎn)要介紹了 HILIC的分離機(jī)制，固定相，聯(lián)用技術(shù)，并綜述了其在體內(nèi)藥物分析中的研究進(jìn) 展。關(guān)鍵詞 親水作用色譜；體內(nèi)藥物分析；分離機(jī)制；固定相Hydrophilic interation charomatograph

2、y and its ResearchDevelopment in Biopharmaceutical AnalysisAbstract Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) is popular in the analysis of hydrophilic solute in recent years. Hydrophilic interaction chromatography(HI LIC) separation system consists of polar stationary phase and mobile phase wit

3、h high polar organic solvent content and small portion of water phase. It has been shown to be a powerful tool for separating polar analytes which have poor retention on traditional reversed-phase liquid chromatography.This article briefly reviews concept, mechanism and stationary phase of HILIC, an

4、d its recenResearch Development in Biopharmaceutical Analysis.Key words HILIC ; Biopharmaceutical Analysis ; stationary phase ; mechanism體內(nèi)藥物分析是對(duì)體液或組織中藥物及其代謝物、生物標(biāo)記物等進(jìn)行的定性或定量分析。生物樣品成分復(fù)雜，因此分析物檢測(cè)手段的選擇成為需要密切關(guān)注的 問題。反相液相色譜（RPLC）是當(dāng)前分離分析和分離制備中應(yīng)用最為廣泛的色 譜模式，其依靠疏水固定相與溶質(zhì)之間的疏水相互作用實(shí)現(xiàn)弱極性和中等極性化 合物的高效分離。生物基質(zhì)中含有其他多種親

5、水性組分， 包括內(nèi)源性物質(zhì)以及外 源性物質(zhì)，當(dāng)目標(biāo)化合物在反相色譜保留較弱時(shí)，可能會(huì)與這些成分發(fā)生共洗脫。 對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留很弱，甚至不保留，因此強(qiáng)極性化合物在上不能得到很好 的分離。目前，用來分離強(qiáng)極性化合物的液相色譜方法主要有離子交換色譜法（IEC）、正相色譜法（NPLC）和親水作用色譜法（HILC）。親水作用色譜（HILIC ）的概念是由Alpert1tr次提出，它是指采用極性固定 相（如硅膠或衍生硅膠）和含高濃度極性有機(jī)溶劑（如乙臘）和低濃度水溶液流 動(dòng)相的色譜模式，具有和反相色譜正交的選擇性所使用的流動(dòng)相與傳統(tǒng)反相色譜 相似，弱洗脫劑為有機(jī)相，強(qiáng)洗脫劑為水相，可達(dá)到與反相色譜相媲

6、美的柱效和 對(duì)稱峰形，化合物的洗脫順序則與正相色譜相似，即以親水性增加的順序流出， 能為親水性強(qiáng)極性的化合物提供合適的保留，含水的流動(dòng)相乂可顯著改善樣品的 溶HILIC分離系統(tǒng)包括極性固定相和流動(dòng)相包括高濃度強(qiáng)極性溶劑低濃度和水。HILIC對(duì)極性化合物的良好保留和獨(dú)特選擇性，已使其成為體內(nèi)藥物定量分析的 重要補(bǔ)充工具。1. HILIC的分離機(jī)制和影響保留的因素1.1 HILIC的分離機(jī)制Alpert1認(rèn)為，極性樣品在 HILIC中的保留基于分配機(jī)理。但同時(shí)指出：導(dǎo)致 兩相之間發(fā)生分配的原因并不活楚，有可能也包含了某些偶極偶極相互作用，并 認(rèn)為弄活保留機(jī)理仍需要大量的研究。在后續(xù)的研究中，也有人

7、提出保留是基于溶質(zhì)在固定相上的吸附2。而更多的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象則表明HILIC的保留機(jī)理包含氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種效應(yīng)3。1.2影響保留的因素HILIC分離效果受到多種因素的影響，例如流速、柱溫、固定相鍵合的基團(tuán)緩 沖體系、緩沖鹽的種類和濃度等4 o Guo等5以及Qinming等6的研究結(jié)果表明， 盡管不同的固定相填料表現(xiàn)出不同的選擇性，但影響樣品在固定相上的保留行為 的最主要因素都是流動(dòng)相中有機(jī)相的比例，例如乙臘含量的增加會(huì)顯著增加樣品 的保留因子。此外，在不同的溫度下，不同樣品在不同固定相上的保留行為變化 趨勢(shì)不一，實(shí)際應(yīng)用時(shí)需根據(jù)所用的色譜柱作有針對(duì)性的調(diào)整。不同種類的緩沖鹽和濃度

8、對(duì)不同樣品在 HILIC色譜柱上的保留影響也不相同。2. HILIC的固定相HILIC固定相的種類繁多，不同HILIC固定相具有不同的選擇性和適用范圍， 而對(duì)HILIC固定相的保留特性缺乏系統(tǒng)的研究，因此選擇“合適”的HILIC色譜柱十分困難。目前已有多種商品化 HILIC色譜柱面市，其中多數(shù)為硅膠基質(zhì)， 也有少數(shù)采用聚合物基質(zhì)，以滿足更大范圍流動(dòng)相條件的變化。2.1 NPLC固定相直接用于HILICNPLC使用的極性固定相主要有純硅膠、氨基鍵合相、割基鍵合相和二醇基鍵 合相等。這些固定相具有較強(qiáng)的極性和親水性，都能直接用于HILIC。2.1.1硅膠固定相美國(guó)Water公司還專門推出了硅膠親水

9、色譜柱，由于硅膠表面沒有修飾層，因而硅膠的表面吸附活性、表面結(jié)構(gòu)不均勻性和硅羥基的酸性使色譜峰形和分離重 復(fù)性產(chǎn)生一定的問題。另外，由于缺乏修飾層的保護(hù)，純硅膠固定相在模式下的使用壽命較短，一般只能進(jìn)樣 500次左右7。Water公司提出了有機(jī)無機(jī)雜化 硅膠的概念并推出了系列色譜柱，乙基橋雜化硅膠被應(yīng)用于，其使用壽命比純硅膠柱有了很大提高8。2.1.2二醇基鍵合相和割基鍵合相二醇基鍵合相和割基鍵合相等正相固定相也可以用于HILIC模式，但同樣由于鍵合相親水性不足，存在著溶質(zhì)保留時(shí)間較短的問題9。2.2新型HILIC固定相當(dāng)前HILIC固定相的種類很多，根據(jù)鍵合相的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，HILIC固

10、定相可分為酰胺型、多元醇羥基型和兩性離子型等。這幾類基團(tuán)具有很好的親水 性，十分適合作為親水色譜的固定相，而且在一定程度上可以解決傳統(tǒng)正相固定 相用于HILIC所存在的問題。2.2.1兩性離子固定相（ZIC-HILIC）兩性離子是指在一個(gè)分子中同時(shí)"在正電荷中心和負(fù)電荷中心。Irgum等10將兩性離子固定相應(yīng)用于離子色譜中，發(fā)現(xiàn)使用純水就可以進(jìn)行離子色譜分離。 兩性離子固定相在離子色譜模式下的分離機(jī)理說明了其具有很好的親水性，適合用于HILIC模式。最近對(duì)多種氨基糖苜類藥物在多種HILIC柱上色譜行為的系統(tǒng)研究表明11,與未修飾硅膠柱氨基柱和酰胺柱相比能實(shí)現(xiàn)最佳分離；柱溫影響檢測(cè)靈敏

11、度而與保留時(shí)間無關(guān);流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度影響峰型和保留時(shí)間。2.2.2離子交換固定相常用于離子交換色譜的離子型固定相具有很好的親水性，因此也可以應(yīng)用于 HILIC模式?；诹姿峄脑贖ILIC模式下離子型固定相上的保留特性，Alpert12 于2008年提出了電荷抑制的親水作用色譜（ERLIC）,實(shí)質(zhì)為離子排斥與親水 作用混合色譜模式。3. HILIC在體內(nèi)藥物分析中的特點(diǎn)未經(jīng)衍生化的普通硅膠柱目前是應(yīng)用最為廣泛的HILIC色譜柱，對(duì)于堿性藥物，需要酸性的流動(dòng)相，未衍生硅膠柱在HILIC模式下因處于高有機(jī)相環(huán)境中， 不會(huì)如處于反相色譜條件時(shí)那樣易溶解。同時(shí)，HILIC還能獲得高的色譜柱效對(duì)稱的峰

12、形。HILIC以高濃度有機(jī)溶劑和低含量水組成的流動(dòng)相，具有低黏度和高滲透性的特點(diǎn),與相似柱粒徑和流速的反相液相色譜相比，色譜柱壓大大降低， 因此可在高流速下以低反壓進(jìn)行分離，從而實(shí)現(xiàn)快速分析。HILIC所使用的高揮發(fā)性有機(jī)相尤其適宜與電噴霧（ESI ）質(zhì)譜聯(lián)用，可提供良好的靈敏度。由于 HILIC進(jìn)樣時(shí)采用高比例有機(jī)溶劑，生物樣品制備過程最后一步無需以高水相 有機(jī)溶劑復(fù)溶，可有效提高樣品通量13,對(duì)不穩(wěn)定或不適合蒸發(fā)復(fù)溶的分析物 還可得到更低的檢出限和更高的回收率。由于 HIL IC利用被測(cè)組分與硅羥基的 相互作用，因此不需要加離子對(duì)試劑（如烷基磺酸鹽）的洗脫液就能對(duì)大范圍內(nèi)的 堿性藥物進(jìn)行分

13、離，流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，一般為甲醇-水相緩沖液或乙臘-水相緩沖液, 常用的緩沖液有硝酸鉉-氨水、乙酸鉉-乙酸/甲酸/三氟乙酸及磷酸鹽/磷酸等13。 HILIC的流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，固定相穩(wěn)定。4. HILIC聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展4.1 HILIC-MS 聯(lián)用HILIC可以為強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性的化合物提供合適的保留，而且含有高濃度水 溶性有機(jī)相的流動(dòng)相乂有利于提高質(zhì)譜的離子化效率，進(jìn)而提高質(zhì)譜分析的靈敏度。HILIC-MS/MS被稱為生物分析中的一種高通量定量分析手段。這種聯(lián)用技 術(shù)已被成功地用于定量分析藥物、生物內(nèi)源性代謝物、離子液體以及某些結(jié)構(gòu)相似的極性化合物或其代謝的同時(shí)分離分析中。Guo等14比較了用R

14、PLC-MS和HILIC-MS方法分析人尿樣中常見含氮類化 合物的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)對(duì)于這些極性化合物，HILIC-MS的靈敏度較高，且能檢測(cè)出該類代謝物的數(shù)目也遠(yuǎn)多于 RPLC-MS方法。Pei li15等采用HILIC-MS技術(shù) 用于進(jìn)行可替寧在小鼠的血漿和腦組織中代謝和含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn) HILIC-MS與 LC-MS相比較，靈敏度更高。4.2 HILIC的在線聯(lián)用對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中的靶標(biāo)物質(zhì)，通過引入柱切換技術(shù)，選用較短的預(yù)柱或固相萃 取固相微萃取(SPE/SPME )手段，將目標(biāo)組分從復(fù)雜基質(zhì)背景中分離萃取出 來，并通過電磁閥和管線轉(zhuǎn)移至分析柱上進(jìn)行分離，可以完成包括除鹽、去蛋白、捕集和濃縮痕量組分

15、等樣品預(yù)處理過程，實(shí)現(xiàn)預(yù)處理和分析過程的在線聯(lián)用。 除了能夠獲得和離線處理過程相似的分析結(jié)果外，還能有效減小分析誤差，節(jié)約人力和時(shí)間，節(jié)省樣品量和溶劑使用量，提高分析效率和自動(dòng)化程度。目前，已有 少量采用 固定相作為HILIC填料用于樣品分析的在線預(yù)處理步驟的報(bào)道。隨著填料的不斷發(fā)展和親水性樣品的分析任務(wù)的增加，HILIC在這方面的應(yīng)用會(huì)有更多報(bào)道研究。4.3 HILIC與RPLC的在線聯(lián)用在復(fù)雜樣品的實(shí)際研究過程中，經(jīng)常需要同時(shí)了解其中親水性組分和疏水性組 分的組成。采用一維液相色譜(無論HILIC還是RPLC)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)只能獲得其中一類代謝產(chǎn)物的信息。死時(shí)間流出的色譜峰通常被排除在后續(xù)數(shù)

16、據(jù)分析過 程之外，造成分析方法導(dǎo)致的代謝物信息丟失。但離線的操作方式耗時(shí)耗力，也 容易引入偶然誤差，對(duì)于代謝組學(xué)研究要求的樣品分析通量和海量數(shù)據(jù)的可靠 性，仍然有一定的差距。HILIC-RPLC在線聯(lián)用系統(tǒng)16具有操作簡(jiǎn)便、靈活性好、普適性強(qiáng)、分析通量 高、數(shù)據(jù)處理方便，與常規(guī)一維分離相比能顯著提高分析的分辨率和峰容量等優(yōu) 點(diǎn)，可以滿足復(fù)雜樣品中親水性和疏水性組分同時(shí)定性定量分析的要求?？梢詸z測(cè)出比常規(guī)HILIC-MS方法更多的代謝物，有助于構(gòu)建更加穩(wěn)定和可靠的多變 量數(shù)據(jù)分析模型，有利于發(fā)現(xiàn)更多的潛在標(biāo)記物，從而得到更加全面和準(zhǔn)確的代 謝組學(xué)研究結(jié)果。5. 結(jié)語與展望色譜條件與樣品前處理中所

17、用有機(jī)溶劑兼容，可節(jié)約大量樣品前處理時(shí)間，并與質(zhì)譜尤其是 離子源質(zhì)譜良好兼容，適用于藥物研發(fā)中藥理蠹理學(xué)評(píng)價(jià)藥代動(dòng)力學(xué)研究治療藥物監(jiān)測(cè)和臨床診斷研究中的高通量分析實(shí)際上，HILIC的應(yīng)用領(lǐng)域已不再局限于極性小分子藥物及代謝物，相對(duì)非極性的化合物和多肽蛋白類藥物的成功分析亦見報(bào)道17通過構(gòu)建新型流路，HILIC與反相色譜的離線或在 線結(jié)合應(yīng)用可極大提高對(duì)復(fù)雜體系樣品的分離效率，尤其適合代謝組學(xué)研究具有獨(dú)特選擇性的新型填料不斷面世18,提供了更高的柱效更廣的選擇性和更好的 耐用性 亦有采用固定相作為填料的報(bào)道，HILIC對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中親水性樣品進(jìn)行 除鹽等預(yù)處理19近年來，可用于HILIC分離的毛細(xì)

18、管整體柱20和微控流芯片21 等新技術(shù)不斷興起，拓寬了HILIC的應(yīng)用領(lǐng)域有研究發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相如使用含高濃度二氧化碳的乙醇-水體系，能達(dá)到與高污染的傳統(tǒng)乙臘水體系相似的色譜表現(xiàn)， 在化學(xué)研究更加關(guān)注環(huán)保的今天具有重要啟發(fā)意義。目前，HILIC模式的分離機(jī)理還不是十分明確，HILIC存在著多種復(fù)雜的相互作用。此外，對(duì)主要的HILIC色譜柱進(jìn)行系統(tǒng)的色譜評(píng)價(jià)也是推廣HILIC應(yīng)用的基礎(chǔ)，但是當(dāng)前缺乏的評(píng)價(jià)方法和評(píng)價(jià)樣品。色譜柱生產(chǎn)商評(píng)價(jià)色譜柱時(shí)所選擇的樣品也不盡相同，大多數(shù)只是給出少數(shù)幾個(gè)樣品的柱效，不能全面地反映色 譜柱的特性。隨著HILIC在體內(nèi)藥物分析應(yīng)用逐漸廣泛，需要建立包含幾種典型 極性(親

19、水)物質(zhì)的 HILIC色譜柱“評(píng)價(jià)樣品體系”，為HILIC應(yīng)用中色譜柱 的選擇提供參考以及系統(tǒng)研究并闡明其分離機(jī)制將是今后的重要研究課題之一。參考文獻(xiàn)1 Alpert AJ.Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides,nucleic acids and other polar compoundsJ. J Chromatogr,1990, 499:177-196.2 Yoshida T.J Biophy Methods, Interplay of Chromatographic Parameters

20、and Analyte PhysicalProperties on Retention and Selectivity in Hydrophilic Interaction Liquid ChromatographyJ. Anal. Chem,2004, 60(3):265.3 李瑞萍，黃駿雄.親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定化妝品中三聚停胺殘留量J.化學(xué)進(jìn)展,2006,18(11):1508.4 Tijana R, Biljana J S.Improved chromatographic response function in HILIC analysis: Applicationto mix

21、ture of antidepressants.TalantaJ.2012,98(23) 54 -61.5 GuoY,Gaiki S. Retention behavior of small polar compounds on polar stationary phases in hydrophilic interaction chromatographyJ.J Chromatogr A,2005,1074(2):71.6 Quiming N S,Denola N L. Development of retention prediction models for adrenoreceptor

22、 agonists and antagonists on a polyvinyl alcohol-bonded stationary phase in hydrophilic interaction chromatographyJ.Anal Chim Acta,2007,598:41.7 Grumbach E S,Diehl D M,Neue U D. The application of nov el 1.7 m ethylene bridged hybrid particles for hydrophilic interaction chromatographyJ. J Sep Sci,2

23、008,31(9):1511.8 王媛,顧惠新.以親水作用色譜為核心的液相色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用研究J.色 譜,2008,26(6):649-657.9 Strege M A. Hydrophilic interaction chromatography-electrospray mass spectrome try analysis of polar compounds for natural product drug discoveryJ.Anal Chem, 1998, 70(13):2439.10 Qiu H,Wanigasekara E,.Development and evaluat

24、ion of new zwitterionic hydrophilic interation liquid chromatography stationary phases based on 3-P, P-diephenylphosphoum -propysulsulfonateJ.J Chromatogr A,2011,1218(44:8075-8082.11 Kumar P,Rubies A.Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of aminoglycosidesJ.J Sep Sci,2012,35(4):498

25、-504.12 Alpert A J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptidesJ.Anal Chem, 2008, 80(1):62.13 Song Q,Naidong W.Analysis of omeprazole and 5-OH omeprazole in human plasma using hydrophilic intera

26、ction chromatography with tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) -eliminating evaproration and reconstitution steps in 96-well liquid/liquid extractionJ.J Chromatogr B,2006,830(1):135-142.14 Shen Y, Zhang R, Moore RJ, Kim J, Metz TO, Hixson KK, et al. Automated 20 kpsiRPLC-MS and MS/MS with chromato

27、graphic peak capacities of 1000-1500 and capabilities in proteomics and metabolomics. Analytical chemistry. 2005; 77:3090-100.15 Li P, Beck WD, Callahan PM, Terry AV, Jr., Bartlett MG. Quantitation of cotinine and its metabolites in rat plasma and brain tissue by hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS). Journal of chromatography B, Analytical technologiesin the biomedical and life sciences. 2012; 907:117-25.16 Simon R, Enjalbert Q, Biarc J, Lemoine J, Salvador A. Evaluation of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) versus C(18) reversed-p