免疫熒光方法

1、免疫熒光（Immunofluorescence, IF ）實(shí)驗(yàn)方法免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測定含量。免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵 育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生

2、細(xì)胞掉片， 一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips ）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出 許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性 質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot ）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作， 此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4C或-20 C避光保存，以免

3、因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無法像WBB樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個(gè)完美的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外， 還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對照?？傊庖邿晒鈱?shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹；緦?shí)驗(yàn)步驟：（1） 細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用 PB

4、S離心洗滌（1000rpm,5min ） 2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直 接制備細(xì)胞涂片。（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納 的PBS中4C保存3個(gè)月。PBS洗滌3X 5 min.（3）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在 5-15min.通透后用PBS洗滌3X 5 min.（4） 封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.（5） 一抗結(jié)合。室溫孵育 1h或者4C過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5mi

5、n.（6） 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次 沖洗5min后，再用蒸儲水漂洗一次。（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。（一）細(xì)胞準(zhǔn)備用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時(shí)直接放入coverslips 讓細(xì)胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免 疫熒光實(shí)驗(yàn)，以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實(shí)驗(yàn)需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。（二

6、）固定和通透除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的目的有三： 防止細(xì)胞從玻片上脫落； 除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂； 使標(biāo)本易于保存。標(biāo)本的固定原則是： 不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原； 不能凝集蛋白質(zhì)； 應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進(jìn)入所有細(xì)胞與亞細(xì)胞組分與抗原結(jié)合。常用的固定劑有多種，應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當(dāng)?shù)墓潭?劑。通常固定方法可以分為兩類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂 并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

7、。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但因?yàn)榻宦?lián)阻礙抗體結(jié)合， 可能會降低一些細(xì)胞組分的抗原性，因此需要增加一個(gè)通透步驟以使抗體能夠進(jìn)入標(biāo)本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進(jìn)行固定。 通常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進(jìn)行通透以使抗體能達(dá)到抗原表位。通透步驟只在檢測細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要，因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢

8、測蛋白。但是，如果待檢測的是跨 膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細(xì)胞進(jìn)行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位于 膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)行通透。 丙酮本身 具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時(shí)是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，因?yàn)橐恍┍砦粚状挤浅Ｃ舾小３Ｓ玫耐ㄍ竸┦侨ス竸?，如Triton ,NP-40, 以及 Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm 等。Triton 和 NP-40 屬于烈性去垢劑，可部分溶解細(xì)胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時(shí)間過長，它們將破壞蛋

9、白，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Triton X-100是最常用的通透劑， 但是它將破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗，最后以 蒸儲水沖洗，防止自發(fā)性熒光。（三）封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1% BSA, PB

10、S pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有1% gelatin, 1%bovine或與二抗種屬相同的 血清（3-10%）等。（四）抗體孵育直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時(shí)候必須注意避光。 此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥， 抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)行。（五）封片及熒光觀察標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察，特別是有時(shí)候封片不當(dāng)反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，以便進(jìn)一步觀察、照像、統(tǒng)計(jì)分析等，需作封片 處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強(qiáng)封片的效果，往往需要在封片時(shí)添加特殊的抗熒光淬滅劑。（六）標(biāo)本保存由于熒光

11、色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時(shí)間的延長，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光 淬滅劑的出現(xiàn),熒光標(biāo)記的標(biāo)本可以在低溫（4C或-20 C）下保存相當(dāng)長的時(shí)間。 在某些情形下，考慮到實(shí) 驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件， 也可以采取權(quán)宜的辦法， 比如固定標(biāo)本片后低溫保存，在需要時(shí)再進(jìn)行熒光標(biāo)記，即隨用隨染。直接免疫熒光法測抗原基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高， 非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制

12、備一種熒光抗體。 此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水（PB0 : 0.01mol/L , pH7.4熒光標(biāo)記的抗體溶液：以 0.01mol/L , pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液1份配制搪瓷桶三只（內(nèi)有 0.01mol/L , pH7.4 的 PBS 1500ml）有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）熒光顯微鏡玻片架濾紙H37 C溫箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1、 滴加0.01mol/L , pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕 度。2、滴加適當(dāng)

13、稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保 溫一定時(shí)間（參考： 30min）。3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L ,pH7.4的PBS7中洗后，再按順序過0.01mol/L , pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸 3-5 min ,不時(shí)振蕩。4、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆 蓋。5、 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“ +”表示：（-）無熒光；（土）極弱的可疑熒光；（+ ）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+ -+ ）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)"+”以上，而各種對照

14、顯示為 （土）或（-）,即可判定為陽性。注意事項(xiàng)1、對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過 1: 20,抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。2、 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般 30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25C左右），高于 37C可加強(qiáng)染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2 C的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較 37C30 min效果好的多。3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒 光染色的干擾。(1) 標(biāo)本

15、自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加 1-2滴0.01mol/L , pH7.4的PBS(2) 特異性對照(抑制試驗(yàn))：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性 抗體。(3) 陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒 光，則為特異性陽性染色。4、 一般標(biāo)本在局壓汞次照射超過3min ,就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好 在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。免疫熒光染色(間接法)1、 切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持 一定的濕度，37C作用30min。然后用0.01mo

16、l/l pH7.2PBS洗兩次，10min,用吸水吸去或 吹干余留的液體。2、 再滴加間接熒光抗體(如兔抗人-球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色 30min ,37C,緩沖鹽水洗兩次10min,攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。對照染色：抗體對照：用正常兔 血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié) 果應(yīng)為陰性。抗原對照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。陽性對照。間接法中上述方法稱雙層法(Double Layer Method )。另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其 上，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下： 切片或涂

17、片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。 滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37 C , 30min。 緩沖鹽水洗2次，每次5min,吹干。 滴加特異性熒光抗體再用切片于37C, 30min。 如水洗。 緩沖甘油封固，鏡檢。易生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)頻道-生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)資料庫！細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測-間接免疫熒光法細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測過程與細(xì)胞表面抗原檢測過程基本一致，只是在與一抗孵育前， 需要預(yù)先對細(xì)胞用非離子去污劑進(jìn)行透化處理?！静僮鞣椒ā?1) 取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片(石蠟或冰凍切片)；(2) 用含0.2%TritonX-100 或NP-40的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞2min (室溫)，有 些標(biāo)本可

18、能需要長達(dá) 15min ,時(shí)間視抗原而定；(3) 余下步驟接上述“細(xì)胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟(2);【注意事項(xiàng)】(1) 在使用前，一抗二抗均應(yīng)測試其合適的稀釋度。（2）多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長，則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。 因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長。（3）信號微弱的解決方法： 提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性，這必須測試各種濃度抗體的滴度； 延長一抗和二抗的孵育時(shí)間。由于細(xì)胞染色時(shí)抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時(shí)間較在溶液中長。孵育時(shí)間可因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)作適當(dāng)調(diào)整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在