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文檔簡介
1、免疫血清的制備免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等),也可供特異性免疫治療用。免疫血 清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫 原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體,常可獲 得高效價的免疫血清。免疫血清的制備是常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。高效價、高 特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等),也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效 價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如 以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體,??色@得高效價 的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時,則
2、需同時加 用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決 于免疫用抗原的純度。因此,如欲獲得高特異性的免疫血清, 必須予先純化抗原。此外,抗原的劑雖、免疫途徑及注射抗 原的時間間隔等,也是影響免疫血清效價的重要因素應(yīng)予重 視。一、原理具有免疫原性的抗原可刺激機體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的 B細(xì)胞克隆所識別,因此由某一抗原刺 激機體后產(chǎn)生的抗體,實際上為針對該抗原分子表面不同決 定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外,抗體的產(chǎn)生具有 回憶應(yīng)答的規(guī)律性,抗 m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射 后的抗體應(yīng)答特點截然不同。是由于記憶性
3、B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。二、免疫方法根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛,以酒精及碘 酒消毒皮膚;2. 第一次免疫:用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA) 乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml,每側(cè)腳掌皮下各 注入0.5ml。3. 第二次免疫:間隔 10-14天后,于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG,每淋巴結(jié)注 0.1ml ,其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時,直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。4. 間隔7-10天后,從耳靜脈采血 0.51.0ml ,分離血清,以雙相瓊
4、脂擴(kuò)散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應(yīng)達(dá)到1 : 16以上時才能放血。5. 若效價未達(dá)到要求,可用不加佐劑的抗原液(人IgG) 耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次,分別為0.1、0.3、 0.5ml。間隔1周再試血。如效價達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另 外,也可在第2次免疫后,以弗氏不完全佐劑 (FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑雖 和間隔均同第2次,再試血測抗體效價,如效價達(dá)到要求立 即放血。三、放血(一)心臟采用血法1. 家兔仰面,四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定);2. 剪去左胸部兔毛,消毒皮膚;3. 用左姆指摸到胸骨劍突
5、處,食指及中指放在右胸處 輕輕向左推心臟,并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后,以左 拇指觸摸心臟搏動最強的部位;4. 用50ml注射器(連接16號針頭),傾針45角度, 對準(zhǔn)心搏最強處刺入心臟抽血致死;5. 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中,待凝固后 分離血清。(二)頸動脈放血法1. 家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛 及消毒皮膚;2. 沿頸部中線切開皮膚約 10cm,分離皮下組織,直至 暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌;3. 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織,暴 露出頸總動脈后使之游離;4. 于動脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠(yuǎn)心及近心 端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住
6、;5. 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口, 插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上, 以防放血管滑脫;6. 松開血管夾,使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一 只家兔可放血 80100ml o四、分離血清1、將三角燒瓶的血置 37 C溫箱1小時2、再置4C冰箱內(nèi)34小時。3、待血液凝固血塊收縮后,用毛細(xì)滴管吸取血清。4、于3000rpm離心15分鐘,取上清加入防腐劑(0.01 % 硫柳汞或0.02 %疊氮鈉,最終濃度)5、分裝后置4 C冰箱中保存?zhèn)溆?。五、結(jié)果鑒定以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價,并 用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)雖,應(yīng)產(chǎn)生單一的 沉淀孤線。鑒
7、定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。六、材料(0 動物:健康成年家兔,雄性,體重23公斤。(二一)器材:男刀、鍥子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號、6 號)、稱H瓶(10ml)、H筒、動物固定架、滅菌二角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。(三)試劑1. 滅菌生理鹽水;2. 純化人 IgG(10mg/ ml);3. 消毒酒精及碘酒;4. 羊毛脂;5. 石蠟油;6. 活卡價苗(BCG)(75mg/ ml);7. 弗氏不完全佐劑(FIA)制備:稱羊毛脂10克,逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油 40ml,邊滴邊研磨,分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml),高壓滅菌(8磅20分鐘)后保存?zhèn)溆谩?/p>
8、8.弗氏完全佐劑乳化抗原 (FCA-IgG)的制備將 FIA 予溫(60 C 30分鐘),吸取 3ml于研缽中,逐滴加入活 BCG(75m ml)0.5ml 及純化人 IgG2.5ml(2.4mg / ml)抗_滴 入邊研磨直至形成均一性的乳狀液,取1滴滴于冷水面上不散開為合格。七、注意事項1. 免疫用實驗動物的抗體反應(yīng)性個體差異性較大,因 此免疫時至少應(yīng)選用兩只以上動物。另外,不能使用妊娠動物。2. 免疫用的抗原必須經(jīng) FCA或FIA充分乳化后才能注射,否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的 方法較費時、費力。采用 H-81微型振蕩混合器法或三腔管 研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑
9、按比例混合后,置于混 合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)/分,振幅6mm)后者是 將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后,吸入注射器內(nèi)再將 注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價的免疫血清,但若抗原不純時,可使抗原中極微雖的污 染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體,以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影 響。另外,有些實驗動物種系對BCGG±敏,尤其是豚鼠其次是家兔,當(dāng)再次注射完全佐劑時,可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此,第二次免疫注射時應(yīng)減少佐劑中BCG勺含雖或改用不完全佐劑,以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。4. 抗原的劑H決定于抗原的種類。對免疫原性強的抗 原劑雖應(yīng)相別較少,免疫原性弱的抗原劑雖可相對較多???原的用雖一般以體重計算。在使用佐劑的情況下,一次注入 的總劑雖以0.5mg/kg體重為宜。如不加佐劑時劑雖
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