親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑

1、中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期中國(guó)科學(xué)雜志社SCIENCE IN CHINA PRESS關(guān)鍵詞中藥血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑篩選親和色譜固定化酶親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑黃燕,田清清，李譚瑤，陳波，姚守拙* 湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410082; 湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410081* 通訊作者,E-mail: szyao收稿日期：2009-06-11;接受日期：2009-06-21摘要以殼聚糖微球?yàn)檩d體、戊二醛(glutaraldehyde, GA)為交聯(lián)劑對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin co

2、nverting enzyme, ACE)進(jìn)行固定化.用固化的ACE作為親和介 質(zhì)，利用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)與 ACE之間的親和作用，結(jié)合高效液相色譜對(duì)親和前后的體系進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者各組分色譜峰的差異，以此實(shí)現(xiàn)快速篩選復(fù)雜體系中的ACE抑制劑.應(yīng)用賴諾普利(Lisinopril)、九肽抑制劑、依那普利J (Enalapril)、培哚普利(Perindopril)、卡托普利 (Captopril)等已上市的ACEI對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，反映方法具有高度選擇性將方法應(yīng) 用于中藥地龍及山楂篩選，發(fā)現(xiàn)共有5個(gè)組

3、分與ACE有親和作用，并且都能抑制 ACE酶活性，它們對(duì)酶活性抑制的IC50值在0.454.62用/mL范圍.通過對(duì)親和方 法重現(xiàn)性考察，6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%,說明方法可靠.提出的親和色譜-色譜指紋差異法非常適合于從中藥及天然產(chǎn)物等復(fù)雜混合物庫中快速篩選靶點(diǎn)活性 物質(zhì)#中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期#中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期1引言中藥的有效性毋庸置疑.然而在近現(xiàn)代主流藥 學(xué)中，中藥僅扮演著配角角色，根本原因在于藥效物 質(zhì)基礎(chǔ)不明.中藥藥效物質(zhì)的闡明對(duì)于中藥的質(zhì)量 控制、新藥研發(fā)及毒性控制有著重要意義14.在高血壓治療中，目前已知的具降

4、壓作用的中藥有70多種.其中天麻、鉤藤、菊花等可有效改善眩暈；柴胡、 龍膽草、地龍等可緩解急躁易怒；山楂、五味子、柏 子仁能改善心悸失眠等.盡管作用各不相同，但都有 明確的降壓作用.探尋這些中藥中的有效物質(zhì)對(duì)于 合理解釋中藥的作用機(jī)理、開發(fā)新型抗高血壓藥物有著明顯意義.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(An giote nsin con vert ing en-zyme, ACE)是一種膜固定的二肽羧基金屬蛋白酶 在體內(nèi)它能將血管緊張素1(十肽,Ang I)水解成血管緊張素11(八肽,Ang II),而使得血管收縮，引起血壓 升高.目前，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensinconverting en

5、zyme inhibitor, ACEI)是一類極為重要的 高血壓治療藥物但人工合成的ACEI存在一些不良 反應(yīng)，如咳嗽、味覺功能紊亂及皮疹等.因此從天然產(chǎn)物及中草藥中篩選新的ACEI將為高血壓的治療提供新的藥物.酶抑制劑的篩選方法主要被劃分為兩類：均相溶760Icmic Jouninl lilcctrwiic Publishing 1 louse. All rip hi液酶法和固相酶法.前者以溶液酶作為酶源，在酶溶 液中加入底物和抑制劑，共同反應(yīng)一段時(shí)間后，通過 檢測(cè)溶液酶的活性，來評(píng)估抑制劑對(duì)酶的抑制效果后者將酶固定化,制成酶柱或酶反應(yīng)器，通過檢測(cè)酶 與抑制劑特異性結(jié)合的效果，來實(shí)現(xiàn)對(duì)酶抑

6、制劑的 篩選目前，ACEI的篩選方法主要基于前者.親和色譜是利用生物分子間親和吸附和解離來 進(jìn)行的一種分離方法，分離過程具有高度的生物作用定向性；近年來，該法被廣泛用于藥物篩選研 究1,2,57，并在天然產(chǎn)物活性成分篩選中體現(xiàn)出高效 的特點(diǎn)在ACE固定化方面，Megias等8,9通過交聯(lián) 的方法，將ACE固定在瓊脂糖表面，以此作為親和 色譜填料，從太陽花和油菜籽的蛋白水解液中提取 出ACE抑制肽孫鳳祥等10用碳二亞胺為交聯(lián)劑， 將ACE交聯(lián)在殼聚糖上制成親和色譜柱，對(duì)豬骨膠 原蛋白酶解物中的 ACEI進(jìn)行分離純化 Tang等11將 ACE固定在毛細(xì)管內(nèi)壁，發(fā)展了一種在線檢測(cè) ACEI 活性的毛

7、細(xì)管電泳法.文炫等12比較了包埋法和共 價(jià)結(jié)合法對(duì)固化 ACE的影響，其結(jié)果顯示采用苯甲 磺酰氯法固化ACE,酶固相化效率高，酶活性保留較 好.本課題組13將ACE通過共價(jià)交聯(lián)固定在殼聚糖 糖珠表面，獲得了良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；高活力固定化ACE的研究為ACEI親和色譜提供了基礎(chǔ).本文在前期工作基礎(chǔ)上，以固定化血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶做為親和介質(zhì)，通過親和吸附截留中藥提取 液中部分組分，在進(jìn)行提取液指紋圖譜比對(duì)后，快速 確定中藥中對(duì)酶活性有抑制作用的組分該方法能從復(fù)雜成分中高效挖掘與靶點(diǎn)相互作用的組分，是進(jìn)一步純化、分析、制備有抑制活性的目標(biāo)組分等后 續(xù)工作的基礎(chǔ)2實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑及材料ACE

8、（兔肺，2060 units/mg）及馬尿酸雙甘肽（馬 尿酸甘氨酰甘氨酸，Hip-Gly-Gly，HGG）購自Sigma公 司（美國(guó)）殼聚糖（脫乙酰度90Q%）購自國(guó)藥集團(tuán) （上海）賴諾普利（Lisinopril）、九肽抑制劑、依那普 利（Enalapril）、培哚普利（Perindopril）、卡托普利 （Captopril）購自中國(guó)藥品生物制品檢定所（北京）色譜流動(dòng)相用的溶劑均為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn) 分析純水為Milli-Q lab（Millipore 8美國(guó)）制備的超純水實(shí)驗(yàn)用的地龍、山楂藥材購自老百姓大藥房 （長(zhǎng)沙）22 儀器Waters 2695分離單元（美國(guó)，Waters公司）

9、，包括 低壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱 Waters 996二極管陣列檢測(cè)器 （美國(guó)，Waters 公司）;Micromass ZQ 2000質(zhì)譜檢測(cè)器（英國(guó)，曼徹斯特），配有電噴霧（ESI） 電離源和四級(jí)桿質(zhì)量分析器；Masslynx TM 4.0數(shù)據(jù)處 理軟件 Waters Prep-4000 制備色譜儀，包括 Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（附制備池），M 32色譜工作站 （美國(guó)，Waters公司） C 18分析色譜柱購自大連江申分 離科學(xué)技術(shù)公司23 樣品處理地龍?zhí)崛l件：10 g地龍粉末，用100 mL 01 mol/L硼酸鈉緩沖液（pH 83下同）70C超聲提取90 min

10、，取上清液，過膜，備用山楂提取條件：10 g山楂粉末，用100 mL純水 70C超聲提取90 min，用80%乙醇處理去掉果膠，過 濾后將濾液蒸干，用50 mL 01 mol/L 硼酸鈉緩沖液 溶解，過膜，備用24 酶固定化參照文獻(xiàn)方法13進(jìn)行ACE固定取一定量的殼 聚糖珠按1 : 10（W/V）比率加入25%的GA溶液，室溫 下磁力攪拌交聯(lián) 3 h.反應(yīng)完畢后，去離子水洗，0.3 mol/L NaCl和0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液洗，再用去離 子水洗，直至清洗液中無GA.將ACE酶溶液（0.1mmol/L）按10 : 1（V/W）比率與交聯(lián)殼聚糖珠在室溫下 反應(yīng)1 h（磁力攪拌），然后置于

11、4 C冰箱中反應(yīng)過夜. 反應(yīng)完成后，分別以去離子、緩沖液、去離子水洗，直 至洗凈未鍵合的 ACE.加入0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液， 冷藏待用2.5 親和篩選分別將固化 ACE殼聚糖珠和空白殼聚糖珠濕法 填裝于空的不銹鋼液相色譜柱中（50 mm X 4.6 mm），再分別用0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液洗柱.取2份待 測(cè)樣品溶液分別流過ACE殼聚糖柱和空白殼聚糖柱（柱溫：37 C ），以二極管陣列檢測(cè)器監(jiān)控柱后流 出物，分別收集突破曲線突破點(diǎn)前的流出物流出物Icinic JouniAl lilcctronic Publishing 1 louse. AIL nplit再作HPLC分析，得到流

12、出物的指紋圖譜色譜條件 761黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑如下：地龍：A流動(dòng)相：水(0.1%三氟乙酸),B流動(dòng)相： 乙腈(0.1%三氟乙酸);梯度洗脫：020 min, B由0% 線性增加至 10%; 2025 min, B 由10%線性增加至 40%; 40%維持 5 min.檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm; ODS-C18 分 析色譜柱(200 mm X 4.6 mm),流速：1 mL/min,進(jìn)樣 量：10止.山楂：A流動(dòng)相：水(0.1%三氟乙酸),B流動(dòng)相： 乙腈(0.1%三氟乙酸),梯度洗脫：05 min, B維持在 3%; 510 min, B 由 3%線性增加至 5

13、%; 10 到 20 min, B由5%線性增加至13%; 2030 min, B由13%線性增 加至 22%; 3038 min, B 維持 22%; 3843 min, B 由 22%線性增加至 70%; 4355 min, B 維持 70%; 5560 min, B由70%線性增加至95%; 95%維持5 min.檢測(cè) 波長(zhǎng)：265 nm; ODS-C偲分析色譜柱(200 mm X 4.6 mm),流速：1 mL/min,進(jìn)樣量：10此.2.6活性組分酶活性抑制率的測(cè)定以HGG為ACE底物，采用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè) 定產(chǎn)物(馬尿酸)的含量來評(píng)價(jià)酶的活力，通過空白對(duì) 比及目標(biāo)化合物的加入對(duì)酶

14、活力的影響來確定親和 篩選得到的目標(biāo)成分的酶活性抑制能力.具體方法如下：2 mmol/L HGG 和兔肺ACE(1 mU)反應(yīng)，總反應(yīng)體積為80 pL.對(duì)照組的組成為：40 丄 HGG 4 mmol/L、20 此緩沖液(含 300 mmol/L NaCI 的100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-甲酸緩沖(pH 8.3)和20 PL ACE(1 mU); 對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的組成為：40 丄4 mmol/L HGG、20 pL含目標(biāo)化合物的緩沖液和 20 pL ACE(1 mU). 37 C恒溫水浴鍋中反應(yīng) 8 min后, 加160山含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，旋渦震蕩35 s, 0.45 pm的膜過

15、濾后，進(jìn)樣10 pL.ACE活性抑制率的的計(jì)算公式：ACE活性抑制率(%)=100 X?(HAd/IS-HAs/IS?HAd/IS?式中HAd/IS和HAs/IS分別代表對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組 中馬尿酸和內(nèi)標(biāo)(對(duì)苯二甲酸)的濃度比值.色譜條件：選用C18分析色譜柱，柱溫設(shè)為30 C , Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外測(cè)測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為228 nm.流 動(dòng)相采用0.2 mL/min的乙腈和0.8 mL/min的0.08% 乙酸水溶液等度洗脫.質(zhì)譜條件：流動(dòng)相過色譜柱后按3 : 1分流，以0.25 mL/min的流速進(jìn)質(zhì)譜；用ESI質(zhì)譜的負(fù)離子模 式(ESI-)產(chǎn)生馬尿酸及對(duì)苯二甲酸 (內(nèi)標(biāo))的分子離子 峰

16、M-H-;選擇離子設(shè)置為 m/z 178.1和164.9 (馬尿 酸、對(duì)苯二甲酸M-H-離子的m/z值分別為178.1和 164.9),并用選擇離子對(duì)馬尿酸進(jìn)行定量；毛細(xì)管電壓為3500 V;錐孔電壓為23 V;源溫度為120 C;脫 溶劑氣和錐孔氣流速分別為300 L/h, 60 L/h;萃取電壓為5 V; RF透鏡電壓為0.5 V.3結(jié)果與討論3.1 篩選結(jié)果ACEI通過抑制ACE活性，使Ang H的生成減少， 降低血管阻力，降低血壓.其作用機(jī)理現(xiàn)在一般認(rèn)為 ACEI具備兩個(gè)必要結(jié)構(gòu)特征與酶的活性部位相結(jié) 合：Zn2+配位基團(tuán)與ACE的Zn2+結(jié)合，末端羧酸基與 ACE的正電荷部位呈離子鍵

17、結(jié)合.同時(shí),ACEI具備 輔助基團(tuán)與ACE的其他輔助活性部位結(jié)合,如一些 酰胺里的羰基與 ACE的供H部位呈氫鍵結(jié)合，圖1 為ACEI藥物卡托普利(captopril)與血管緊張素轉(zhuǎn)換 酶的作用機(jī)理.正因?yàn)橐种苿┡c ACE間的多基團(tuán)相 互作用，封閉了 ACE的活性部位，從而產(chǎn)生抑制作 用；因此，通過酶對(duì)中藥混合物進(jìn)行親和吸附，可快速有效地從混合物中定向得篩選出酶抑制劑.圖1 Captopril與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE的作用機(jī)理本文利用殼聚糖固定化 ACE制備親和液相色譜 柱，通過比較親和作用前后各組分色譜峰的差異以 定向篩選中藥中的 ACEI活性組分.為考察篩選方法 的可靠性，即固化ACE是否

18、可以對(duì)ACEI進(jìn)行有效的 特異性結(jié)合,采用本方法對(duì) ACEI藥物進(jìn)行了考察，黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑762Jc-jnic Journal UlcctroiiK Publishing I louse. All right中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期763中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期結(jié)果見圖2.從圖2(a)和(b)中可以發(fā)現(xiàn)Lisinopril及九 肽抑制劑與固化 ACE親和后，其對(duì)應(yīng)的色譜峰明顯 低于空白柱，說明固化ACE能對(duì)這兩種ACEI有效截 留.而Enalapril和

19、Perindopril與過ACE柱后,相比 于空白柱無明顯變化(圖2(c)和(d). En alapril 和 Perindopril為上市前體藥，它們進(jìn)入人體后，需經(jīng)過 水解作用才能生成抑制ACE的活性物質(zhì)，而它們本身對(duì)ACE沒有抑制作用.由于它們不能與固化 ACE 發(fā)生特異性結(jié)合,其濃度與空白柱相比沒有明顯變 化，故實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積沒有 明顯差異.為考察親和柱對(duì)復(fù)雜組分的篩選效率，將lisinopril, perindopril 禾口 captopril 三者均勻混合 ,組成 ACEI組與ACE柱進(jìn)行親和.圖2(e)顯示當(dāng)混合組分 流過ACE柱后，lisinopril與c

20、aptopril的對(duì)應(yīng)色譜峰明 顯小于對(duì)照組，而perindopril的色譜峰與對(duì)照組相比 無明顯變化,表明ACE柱能特異性地吸附復(fù)雜組分 中的ACEI活性物質(zhì).上述結(jié)果說明本文采用的固化 ACE能與ACEI發(fā)生特異性結(jié)合,而不會(huì)與其他非活 性物質(zhì)作用.因此本方法可以準(zhǔn)確、有效地對(duì)溶液中 的ACEI進(jìn)行篩選.圖3(a)和(b)為地龍及山楂樣液在 ACE酶柱親和 及空白柱處理后的指紋圖譜.從親和吸附與空白吸 附對(duì)比譜圖看，地龍?zhí)崛∫褐斜Ａ魰r(shí)間為11.7 min(1#), 13.2 min(2#)及 15.2 min(3#)的組分與酶有明 顯的親和作用；在山楂提取液中，保留時(shí)間為11.2 min(

21、4#)及12.5 min(5#)的組分也有明顯的親和作用，這些組分是潛在的酶活性抑制劑.經(jīng)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致.3.2活性組分酶活性抑制率的測(cè)定采用制備液相色譜法對(duì)地龍及山楂中的15#組分進(jìn)行制備分離，按照2.6節(jié)中的方法測(cè)定得到的 1#5#組分的酶活力抑制率，IC50值(抑制劑對(duì)酶活力 抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度)見表1.從結(jié)果看，與ACE有親和作用的5種組分均表 現(xiàn)出較高的酶活力抑制作用.盡管與上市的化學(xué)合 成酶抑制劑相比，這些組分的抑制活性仍然偏低(如： Captopril 對(duì) ACE 抑制的 IC50 值范圍為 1.34 10.38 ng/mL),但能說明中藥地龍及山楂降壓的機(jī)理部

22、分0.200J5(0W wo0.050.00丄-入_JI0.002.004.006.008.0010.00I2.00I .isiiinpril0.40;0300CaptoprilPerind'ijpril6.0t) S.W 10.0012.00Time f min圖2各種上市的 ACEI藥物與固化 ACE作用后的比較譜圖藥物依次為 (a) Lisinopril; (b)九肽抑制劑；(c) perindopril; (d)enalapril; (e) lisinopril, captopril 和 perindopril 混合組.實(shí)線為固化ACE親和柱組，虛線為空白

23、組#中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期765中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期hina Atadcinic JournalPublishing llou#黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑圖3地龍及山楂親和篩選色譜圖(a)地龍；(b)山楂.1為固化ACE親和柱組，2為空白組.1#5#組分為與ACE特異性結(jié)合的組分黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑表1 1#5#組分對(duì)ACE的IC50值組分IC50 值(|ig/mL)1# 1.12

24、2# 1.673# 4.624# 2.115# 0.45包含ACEI作用.這些組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能研 究正在進(jìn)行中.3.3 篩選重現(xiàn)性由于本方法是通過比較親和作用前后各組分色 譜峰的差異來對(duì) ACEI進(jìn)行篩選,親和作用的穩(wěn)定性 和重現(xiàn)性對(duì)篩選的結(jié)果至關(guān)重要，因此對(duì)方法的重現(xiàn) 性進(jìn)行了考察.以濃度為0.2 mmol/L的Captopril分別 過酶柱及空白柱，重復(fù)6次，峰面積結(jié)果見表2.結(jié)果 顯示，Captopril峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Ralative standard deviation, RSD)分別為 0.90%和 0.38%.由此可見, 在本實(shí)驗(yàn)條件下，方法有很好的重現(xiàn)性.表2 C

25、aptopril HPLC檢測(cè)峰面積的重現(xiàn)性序號(hào)過空白柱后|A/ S過酶柱后iV S1 17890250997425217990218999173318100237998116417823562996141518078293995763617678723996572RSD 0.90%0.38%4結(jié)論本文發(fā)展了親和色譜聯(lián)用HPLC從中藥中篩選ACEI的方法，方法快速、準(zhǔn)確，儀器簡(jiǎn)單，可行性高. 與目前ACEI的篩選方法相比具有三個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)： (1)不需要引入酶底物溶液，實(shí)驗(yàn)消耗小、成本低;(2) 方法簡(jiǎn)單，篩選速度快；(3)可以對(duì)復(fù)雜體系中的 ACEI進(jìn)行篩選.黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管

26、緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑黃燕等：親和色譜法篩選中藥中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑764密 1 尊鬧-2。間 fhina Ajcadciuic Journat El 曲桿罵口蚯 Publishing I louse. All rights res中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué) 2009 年 第39卷 第8期致謝本工作得到國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（批準(zhǔn)號(hào)：2006CB504701）和國(guó)家自然科學(xué)基金 （批準(zhǔn)號(hào):20875028）資助,特此一并致謝.參考文獻(xiàn)1芻E漢法，汪海林.生物色譜技術(shù)分離、鑒定和篩選中藥活性成分世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2000, 2: 9 132 鄭曉暉，趙新鋒，楊榮，王世祥衛(wèi)引茂，鄭建斌.込腎上

27、腺素受體親和色譜及其在苦杏仁活性成分篩選中的應(yīng)用科學(xué)通報(bào)，2007, 52: 2111 21153 梁逸曾，易倫朝，許青松.中藥現(xiàn)代化研究與化學(xué)計(jì)量學(xué)中國(guó)科學(xué) B輯：化學(xué)，2008, 38: 278 2874 鄢丹，肖小河，金城，董小萍.微量量熱法研究黃連中小檗堿類生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的影響中國(guó)科學(xué) B .輯：化學(xué)，2008, 38: 487 4915 Ng E S M，Yang F，Kameyama A，Palcic M M，Hindsgaul 0, Schriemer D C. High-throughput screening for enzyme inhibitors usi

28、ngfrontal affinity chromatography with liquid chromatography and mass spectrometry. Anal Chem, 2005, 77: 61256 Vutukuru S, Kane R S. Surface plasmon resonance spectroscopy-based high-throughput screening of ligands for use in affinityanddisplacement chromatography. Langmuir, 2008, 24: 11784 117897 J

29、onker N, Kretschmer A, Kool J, Fernandez A, Kloos D, Krabbe J G, Lingeman H, Irth H. Online magnetic bead dynamic protein-affinity selection coupled to LC-MS for the screening of pharmacologically active compounds. Anal Chem, 2009, 81: 4263 42708 Megias C, Pedroche J, Yust M M. Affinity purification

30、 of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides using immobilized ACE.J Agric Food Chem, 2006, 54: 7120 71249 Megias C, Pedroche J, Mar Y M. Immobilization of angiotensin-converting enzyme on glyoxyl-agarose. J Agric Food Chem, 2006, 54: 4641 464510 孫鳳祥，王守訓(xùn)，任維棟.親和色譜法從豬骨膠原蛋白酶解物中分離純化血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑中

31、國(guó)生化藥物雜志，2004, 6: 347 34911 Tang Z M, Kang J W. Enzyme inhibitor screening by capillary electrophoresis with an on-column immobilized enzyme microreactorcreated by an ionic binding technique. Anal Chem, 2006, 78: 2514 252012 劉宏，陳蘭英.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的固相化與性質(zhì)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000, 6: 558 56113 洪韞嘉，李譚瑤，陳波，姚守拙.殼聚糖固定化血管緊張

32、素轉(zhuǎn)化酶及其性質(zhì)高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2009, 30: 328 331 Screening of angiotensin converting enzyme inhibitors from traditional Chinese Medicines by affinity chromatographyiciiiic Jounidl Electronic Publishinfi, I louse. All riphtWWW 匚HUANG Yan TIAN QingQing 2, LI TanYao2, CHEN Bo 2 & YAO ShouZhuo 1,2*1. State Key La

33、boratory of Chem/Biosensing and Chemometrics, Hunan University, Changsha 410082, China;2. Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, ChinaAbstract: An angiotensin converting enzyme (ACE) immobilized affinity chromatography was applied to screen an giote nsin converting en zyme in hibitors (ACEIs) from traditi onal Chin ese medici nes (TCMs) based on the en- zyme-i nhibitor in teractio n. ACE immobilized on chitosa n microspheres with glutaraldehyde (GA) as cross-l inking reage nt was used as