發(fā)酵罐操作與發(fā)酵過程中主要生化指標(biāo)測定

1、小型發(fā)酵罐的使用與發(fā)酵過程中主要生化指標(biāo)測定華南農(nóng)業(yè)大學(xué)為研究小型發(fā)酵罐分批培養(yǎng)過程中大腸桿菌的菌體生長狀況，本實驗以分批培養(yǎng)法培養(yǎng)大腸桿菌，通過控 制發(fā)酵過程的溫度、溶氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等參數(shù)，并每小時取樣測OD值和還原糖量，制作菌體生長曲線，以此判斷大腸桿菌的生長發(fā)酵狀況。結(jié)果表明大腸桿菌在發(fā)酵的前三個小時處于生長 延遲期，發(fā)酵36小時為對數(shù)生長期，發(fā)酵 6小時后該菌開始進入平衡期，第8小時時結(jié)束發(fā)酵實驗。發(fā)酵罐是進行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。生產(chǎn)上使用的發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實驗室使 用的小型發(fā)酵罐，其容積可從約1L至數(shù)百升或稍大些。一般來說，5L以下是用耐壓玻

2、璃制作罐體，10 L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動地調(diào)控試驗所需要的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需的設(shè)備1。在當(dāng)今市場上，各廠家生產(chǎn)的發(fā)酵罐會有所差別，但基本原理是相同的，基本結(jié)構(gòu)是類似的。本實驗使用 的是BIOTECH-7BGZ發(fā)酵罐，其結(jié)構(gòu)主要又罐體和控制器兩大部分組成，罐體為一硬質(zhì)玻璃圓筒，底和 頂兩端用不銹鋼板及橡膠墊圈密封構(gòu)成，容積為5L,頂蓋上有多個孔口，分別是加料及接種口補料口、放置DO （溶解氧）電極口、放置 pH電極口、放置消泡電極口、放置取樣管口等2;本罐可配置不同性能的控制器，控制器能完成最基本的功能，它由下

3、列幾部分構(gòu)成：參數(shù)輸入及顯示裝置，用以輸入控制發(fā)酵條件的各種參數(shù)及顯示發(fā)酵過程中罐內(nèi)培養(yǎng)液的溫度，pH、DO （溶氧）的測定數(shù)值。堿泵和酸泵分別用以向發(fā)酵罐加入堿液和酸液以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH;消泡劑加入泵用以向發(fā)酵罐加入消泡劑，以消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生過多的泡沫。自動或人工控制按鈕用以決定本控制器是處在自動控制或人工控制狀態(tài)。電極連接導(dǎo)線：有三條連接導(dǎo)線，分別與 pH、DO和AF （消泡）電極連接。1 .材料與方法1.1實驗材料1.1.1菌種大腸桿菌（E.coil ）1.1.2培養(yǎng)基配方種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0g，蛋白月東1.0g，酵母膏0.5g，牛肉膏1.0g，氯化鈉0.5g，水1000mL ,

4、 pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20g，蛋白腺10g，酵母膏5g,牛肉膏10g,氯化鈉5g ,氯化鉉5g ,水1000mL , pH7.0。1.1.3儀器設(shè)備BIOTECH-7BGZ發(fā)酵罐一套（配套蠕動泵、pH電極、溶氧DO電極、空壓機及所有連接管）、光光度計、 旋轉(zhuǎn)式搖床、離心機、冷藏箱、滴點裝置、電子天平、電磁爐等。1.1.4用具燒杯、三角瓶、量筒、保鮮膜、玻璃棒、比色杯、試管、離心管、移液管、波珠等。1.1.5試劑 泡敵、斐林試劑、0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、40%氫氧化鈉等。1.2實驗方法1.2.1菌種準(zhǔn)備1.2.1.1配制種子培養(yǎng)基 配制種子固體培養(yǎng)基100mL，分裝試管，0.1MPa

5、 (121 C)滅菌20min ,然后擺成斜面。配制種子培養(yǎng)液500mL，各分裝50mL于兩個250mL三角瓶中(作一級種子瓶)，余下的培養(yǎng)液裝進 三個500mL的三角瓶中(作二級種子瓶)， 0.1MPa (121 C)滅菌20min。1.2.1.2接種與培養(yǎng) 上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜面，37 C培養(yǎng)24h。 上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級種子瓶，37 C振蕩(125r/min )培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接二級種子瓶，37C 振蕩(125r/min )培養(yǎng) 10h。1.2.2上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管。配制發(fā)酵培養(yǎng)基4000ml ,置發(fā)酵罐內(nèi)，視情況加入幾滴泡敵。 安裝好

6、發(fā)酵罐，把取樣管、電極插口、補料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套溢流口V2、進水閥 W1 ,使夾套充滿水。用保護罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護罩頂部排氣閥V4,啟動蒸汽發(fā)生器，啟動攪拌馬達(dá)，調(diào)轉(zhuǎn)速300r/min ,開啟冷凝水出水閥 V1 ,開進水閥門S1 ,進行在位滅菌。 將滅菌溫度設(shè)為115 C，保溫時間0.33h,設(shè)為自動。當(dāng)達(dá)到 795s時，滅菌溫度達(dá)到121 C。 滅菌結(jié)束后，不打開保護罩，使發(fā)酵罐自然冷卻至室溫。用75%酒精消毒pH電極和DO電極，接入發(fā)酵罐，連接各電極導(dǎo)線。 流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作開關(guān)選擇堿泵，打開手動開關(guān)，使膠管內(nèi)充滿液體

7、，將輸 出上限設(shè)為15%,下限設(shè)為0,待一切準(zhǔn)備就緒，將 手動”開關(guān)調(diào)節(jié)到 自動”狀態(tài)。設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為 300r/min，空氣流量23L/min、pH7.0、DO100% ,系統(tǒng)進入發(fā)酵狀態(tài)。1.2.3發(fā)酵操作當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度達(dá)到并維持在所需溫度后，取樣(用于接種前培養(yǎng)基成分分析)：松開彈簧夾J2,用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2,將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾 J3,發(fā)酵液被壓入接料瓶，開J2、J3排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊 J2、J3o 接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點燃酒精棉，在火焰保護下，打開接種口，倒入二級種 子，然后旋緊接種蓋，移取火焰圈。接種后立即進行第

8、一次取樣，用于測定細(xì)菌OD值。1.2.4發(fā)酵管理控制發(fā)酵過程的各項參數(shù)(溫度、PH、溶解氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等)，如參數(shù)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，則應(yīng)及時排除。每小時取一次樣，每次取樣 50ml。取樣時先將空氣流量計旋鈕調(diào)至 01L/min，松開彈簧夾J2,用無菌 空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊 J2,將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾 J3,發(fā)酵液被壓入 量筒，當(dāng)達(dá)到40mL,開J2排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊 J3、J2。將樣液入標(biāo)記有取樣時間的三角瓶，用保 鮮膜封口，立即入冰箱冷藏，取完樣要及時清洗量筒。 每次取樣前（每隔1小時）記錄發(fā)酵過程溫度、PH值、DO、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測定數(shù)值，并

9、記錄操作情況。1.2.5發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定1.2.5.1 測定OD值 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取 10mL離心管，與105 C烘2h至恒重，用鑲子夾取入干燥器，待冷卻后 于分析天平上稱重（W0 ）,精確到小數(shù)后 4位，然后準(zhǔn)確取10mL發(fā)酵液，于3000rpm離心10min ,棄 去上清液，用蒸熠水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，與 100 C烘至恒重，用鑲子夾取如干燥器中冷卻， 于分析天平上稱重（W1 ）,精確至小數(shù)后4位，得細(xì)胞干重為 W1-W0。取同一發(fā)酵液，稀釋 2、5、10、 20、50倍，于600nm下測OD值。以0D值為縱坐標(biāo)，菌液濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。均勻

10、取樣品5mL于編號試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一定濃度，在 721分光光度計上測定 A600 ,根 據(jù)菌體濃度與吸光度之間關(guān)系地標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出菌體濃度。其余發(fā)酵液于3C, 2000r/min條件下離心分離8min,上清液裝入編號三角瓶，用于測糖。1.2.5.2測定葡萄糖 樣品處理：用蒸熠水對樣品液進行稀釋待用。標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液：分別吸取5.0mL堿性酒石酸銅甲液和乙液，置于150mL錐形瓶中，加水10mL, 加入玻璃珠2粒，混勻，從滴定管滴加約 9mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在 2min內(nèi)加熱至沸騰，趁沸以每 2 秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)

11、溶液的總體 積，同時平行操作三份，取其平均值，計算每 10mL （甲、乙液各5mL）堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖 的質(zhì)量（mg）。樣品溶液預(yù)標(biāo)定：分別吸取5.0mL堿性酒石酸銅甲液和乙液，置于 150mL錐形瓶中，加水10mL ,加入玻璃珠2粒，混勻，控制在 2min內(nèi)加熱至沸騰，趁沸以先快后慢的速度，從滴定管滴加樣品溶液，并 保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時，以每兩秒 1滴的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點，記錄 樣液消耗體積。 樣品溶液測定：分別吸取 5.0mL堿性酒石酸銅甲液和乙液，置于 150mL錐形瓶中，加水10mL ,加 入玻璃珠2粒，混勻，從滴定管滴加比預(yù)滴定體積少1mL的

12、樣品溶液，使在2min內(nèi)加熱至沸騰，趁沸繼續(xù)以每兩秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積，同 法平行操作3份，得出平均消耗體積。結(jié)果計算：式中：c 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， mg/mL ；V標(biāo)定時消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，mL ;V1 測定時平均消耗樣品溶液體積，mL ;N 被測樣品稀釋倍數(shù)。1.2.6放罐發(fā)酵8小時后，測OD值及還原糖量，當(dāng)發(fā)酵液的 PH不斷上升且為堿性、OD值增長緩慢，且還原糖 量很低時，可判斷發(fā)酵結(jié)束，準(zhǔn)備放罐。 放罐操作同取樣。將全部發(fā)酵液取出后，100 C煮沸10分鐘滅菌，滅完菌的發(fā)酵液可排放入下水道。1.2.7清洗 放罐完畢

13、后，打開自來水進水口，往發(fā)酵罐中注滿水，同時開動攪拌軸攪動清洗五分鐘，排水。 再次注入自來水清洗，操作如 1。 清洗結(jié)束，關(guān)閉電源。2.結(jié)果與分析2.1實驗結(jié)果2.1.1發(fā)酵過程數(shù)據(jù)結(jié)果每小時記錄發(fā)酵過程溫度、PH值、DO、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測定數(shù)值，結(jié)果如下表：表1發(fā)酵過程各參數(shù)值時間發(fā)酵時間h溫度CpH值DO%通風(fēng)L/min轉(zhuǎn)速r/min取樣mL空白377.01002-33002008:300377.0109.02-3300509:30136.96.98124.12.53045010:30236.86.97115.62.53035011:30336.96.9244.02.83035012:304

14、36.96.7446.23.03035013:30537.06.7243.42.03035014:30637.06.9442.12.03035015:30736.97.3938.92.03035016:30836.98.0637.12.030350取完最后一次樣品后放罐 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如下所示：下表2為所測菌液濃度與 OD值間的關(guān)系表。表2菌液濃度與OD值的關(guān)系表干菌體濃度（g/L）1.1600.5800.2320.1160.0580.0232測得OD值1.4310.7710.4810.2690.1270.043根據(jù)表2得到兩者的關(guān)系曲線圖1 ,如下圖：圖1 菌液OD值與干菌體濃度關(guān)系圖

15、得大腸桿菌干菌體濃度 x與菌液OD值y之間的關(guān)系為：y=0.8433x-0.0773則 x=（y+0.0773）/0.8433測定不同時間發(fā)酵液的OD值，確定對應(yīng)時間的菌液濃度，結(jié)果如下表:表3發(fā)酵液OD值與菌液濃度關(guān)系表發(fā)酵時間（h）發(fā)酵 液（mL）空白培養(yǎng)基（mL）稀釋度OD值（y值）x=(y+0.0773)/0.8433干菌體濃度（g/L ）0501倍0.0790.1850.1851501倍0.2550.3940.3942501倍0.6320.8410.8413145倍0.4330.6053.024145倍0.7500.9814.9051910倍0.7290.9569.5661910倍0

16、.8721.1311.371910倍0.8991.1611.681910倍0.9301.1911.9測定不同時間發(fā)酵液的葡萄糖濃度，結(jié)果如下表:表4培養(yǎng)液中葡萄糖含量表編號0123456、7、8空白稀釋倍數(shù)/倍1815121063消耗體積/mL19.177.795.856.084.534.179.5129.017.705.996.014.674.209.28319.41996.16.0914.564.119.6/mL平均消耗體積09.207.816.06674.584.179.4g/L還原糖含量/5318.2118.9118.6315.4312.06.82.1.2數(shù)據(jù)整理及分析由于pH值、DO

17、值、干菌體濃度（g/L ）、葡萄糖濃度（g/L）等數(shù)據(jù)的數(shù)值范圍相差較遠(yuǎn)，難以在同一 個坐標(biāo)圖中綜合分析，故根據(jù)發(fā)酵過程中，表 1的pH值、DO值，表3的干菌體濃度（g/L）,表4的葡萄糖濃度（g/L）等數(shù)據(jù)結(jié)果，整理成下表：表5發(fā)酵過程各參數(shù)數(shù)據(jù)表發(fā)酵時間hpH 值（X0.1 ）DO值%干菌體濃度（0.1） g/L葡萄糖濃度（X1/6） g/L0701091.85111.18169.8124.13.94109.23269.7115.68.41113.46369.24430.293.78467.446.24974.58567.243.495.640.8669.442.1113773.938.9

18、116880.637.1119根據(jù)上表，以發(fā)酵時間h為橫坐標(biāo)，以pH值（0.1）、DO值、干菌體濃度（0.1 ） g/L、葡萄糖 濃度（X1/6） g/L等為縱坐標(biāo)，繪制發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化規(guī)律的坐標(biāo)圖，觀察并分析其變化規(guī)律，從而得到發(fā)酵過程中大腸桿菌的生長情況和培養(yǎng)基的利用情況。注：由于6、7、8號樣品中蛋白質(zhì)含量較多，而葡萄糖較少，用直接滴定法難以滴定，因此 6、7、 8號樣品不予測定和做分析。下圖為發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化規(guī)律曲線圖：大腸桿菌經(jīng)過8個小時的分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中pH值（沖.1 ）、DO值、干菌體濃度（沖.1 ） g/L、葡萄糖濃度（X1/6 ） g/L等參數(shù)的變化規(guī)律曲

19、線如圖所示，可以分為3個階段：第一個階段：大腸桿菌生長的延遲期是0h到2h?？梢詮那€圖看出：在該階段內(nèi)，DO值曲線較原始DO值上升了一點，但幅度不大，基本還是維持在原始DO值的附近值內(nèi)，葡萄糖濃度曲線和干菌體濃度曲線平緩，無明顯變化，即大腸桿菌利用葡萄糖發(fā)生發(fā)酵的呼吸作用低，說明大腸桿菌還在適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。第二個階段：大腸桿菌生長的對數(shù)生長期是 2h到6h?？梢詮那€圖看出：在 2h到3h內(nèi)，DO值急劇下 降，說明大腸桿菌快速生長，需氧量急劇上升，直至 3h到6h內(nèi)，DO值在40%50%的范圍內(nèi)變化，大 腸桿菌代謝能力持續(xù)在高水平上，需氧量也相對地維持在高水平范圍內(nèi) ；葡萄糖濃度曲線在2h后就

20、急劇下 降，大腸桿菌在代謝過程中，利用葡萄糖含量大幅度上升；干菌體濃度曲線在2h到6h內(nèi)急劇上升，大腸桿菌代謝旺盛，菌體快速生長，細(xì)菌很少死亡或不死亡，增長速度呈對數(shù)生長。第三個階段：大腸桿菌生長的穩(wěn)定期是6h后?？梢詮那€圖看出：6h后，菌體濃度曲線趨于平緩，此時生長速率下降，死亡率上升，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，新生的細(xì)菌數(shù)和死亡的細(xì)菌數(shù)相當(dāng)；而DO值在30%左右，是由于菌體數(shù)達(dá)到最大值，仍然需要大量供氧來代謝生長。由于葡萄糖濃度在6h后極低，合成蛋白質(zhì)多，在滴點時生成大量氣泡，無法測得，故不予討論。由于實驗發(fā)酵時間有限，無法完成整個發(fā)酵過程，故不能得到大腸桿菌生長的衰亡期?？傮w上看，大腸桿菌的分

21、批發(fā)酵培養(yǎng)過程，在限制性條件下的生長，經(jīng)歷了延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期 和衰亡期。在發(fā)酵過程中，pH值的影響也是不可忽視的。pH值影響基質(zhì)水解、酶活性、代謝方向，pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。若不控制pH值，在發(fā)酵過程中，葡萄糖的代謝分解成酸和醇，使pH下降，氮的代謝和產(chǎn)物的酸性也會使pH下降，從而影響發(fā)酵效果，故應(yīng)嚴(yán)格控制好pH,該實驗中pH控制在7.0。由pH值曲線圖可以看出，在 6h前，pH嚴(yán)格控制在7.0左右，菌體正 常發(fā)酵生長，6h后，pH值開始上升，說明菌體開始自溶，細(xì)胞死亡。溫度對發(fā)酵的影響：溫度通過影響微生物的酶反應(yīng)速度、發(fā)酵液中溶解氧而影

22、響發(fā)酵；溫度還能影響酶系 組成及酶的特性、以及生物合成方向；溫度還影響基質(zhì)溶解度，氧在發(fā)酵液中的溶解度也影響菌對某些基 質(zhì)的分解吸收。因此對發(fā)酵過程中的溫度要嚴(yán)格控制，可根據(jù)大腸桿菌菌種的生長階段和培養(yǎng)條件綜合考 慮，以及發(fā)酵大腸桿菌的長期經(jīng)驗考慮，設(shè)定該實驗發(fā)酵大腸桿菌的最適溫度是37 C，從表1可以看出，溫度已嚴(yán)格控制在最適溫度要求范圍內(nèi)。在發(fā)酵過程中，通風(fēng)和攪拌的劇烈程度影響著泡沫的形成。通風(fēng)和攪拌程度小，會使發(fā)酵液的溶氧量下降， 影響后續(xù)發(fā)酵，通風(fēng)和攪拌程度大，則易生成泡沫，而增加染菌的機會，使菌體提早自溶，導(dǎo)致菌體產(chǎn)量 下降，故應(yīng)嚴(yán)格控制通風(fēng)和攪拌的程度，該實驗中，通風(fēng)量是23 L/min，攪拌器的轉(zhuǎn)速是303 r/min 。綜合分析，在發(fā)酵過程中