非生物脅迫對擬南芥IQM4基因表達(dá)的影響

1、    非生物脅迫對擬南芥iqm4基因表達(dá)的影響    蕭文慧宋俊威黃小玲周玉萍田長恩【摘 要】本文首先以擬南芥iqm4基因?yàn)樗阉鲗ο螅瑱z索了兩個生物信息數(shù)據(jù)庫，搜索到iqm4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答，并對iqm4基因表達(dá)量進(jìn)行了分析；然后參考數(shù)據(jù)庫所提供的實(shí)驗(yàn)方法，采用半定量rt-rcr技術(shù)驗(yàn)證了幾種非生物脅迫對iqm4基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明鹽和滲透脅迫均能抑制幼苗期iqm4基因表達(dá)，而脫水、低溫和機(jī)械損傷早期能增強(qiáng)iqm4基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)初步證明擬南芥iqm4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。【關(guān)鍵詞】擬南芥；iqm4；非生物脅迫；基因

2、表達(dá)在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ca2+作為動植物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，通過ca2+傳感蛋白及其靶蛋白來調(diào)節(jié)多種生化和細(xì)胞反應(yīng)。鈣調(diào)素（calmodulin，cam）是目前最重要的一類胞內(nèi)ca2+信號受體。在眾多的cams中，除cam7具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性外，其它均無任何酶活性，必需與其下游的靶蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein， cambp）來調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能1。植物中有5個含iq基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族：iqm、myosin、cngc、iqd和camta，其中iqm家族由我們發(fā)現(xiàn)2。擬南芥iqm家族共有6個成員，均含1個iq基序，n-端具有與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6

3、a的同源序列，c-端具有與天花粉素的同源序列。iqm1編碼1個ca2+不依賴型的cambp，影響保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ros）水平，在氣孔運(yùn)動中發(fā)揮重要作用，iqm1缺失抑制了光誘導(dǎo)的氣孔張開，iqm1突變體表現(xiàn)氣孔開度小和根較短的表型3；iqm1過表達(dá)株系則表現(xiàn)為氣孔開度大和根較長4。iqm4（編號為at2g26190）是iqm家族中與iqm1高度同源的成員5，其功能未見報(bào)道。為了研究iqm4的基因功能，本文以iqm4基因?yàn)樗阉鲗ο螅瑱z索了兩個生物資源信息數(shù)據(jù)庫，搜索到iqm4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答；為了驗(yàn)證生物信息數(shù)據(jù)庫中iqm4基因表

4、達(dá)的數(shù)據(jù)，本文開展了鹽、甘露醇、脫水、低溫以及損傷處理對iqm4基因表達(dá)影響的分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步開展iqm4基因的功能研究提供重要理論依據(jù)。1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用的擬南芥（arabidopsis thaliana）為columbia（col）生態(tài)型。ms鹽購自sigma公司，primescript one step rt-pcr kit，rnaiso plus購自takara公司，nacl和manntiol試劑購于上海生工。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 擬南芥培養(yǎng)土壤培養(yǎng)：將經(jīng)過4浸泡3d的吸漲種子直接點(diǎn)種于營養(yǎng)土表面，置于長日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度為22±2，光周期為16h光照/8h黑暗，

5、光照強(qiáng)度為100mol·m-2·s-1，相對濕度為85%，下同）。1/2ms培養(yǎng)基培養(yǎng)：取經(jīng)過4浸泡3d的吸漲種子，用75%乙醇浸泡510s后棄乙醇，再加入0.1% hgcl2浸泡5min后棄hgcl2，用無菌水漂洗34次。最后加入適量的0.3% agar溶液懸浮，接種到1/2ms培養(yǎng)基上，置于長日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。2.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的檢索以iqm4基因?yàn)樗阉鲗ο?，檢索atgenexpress visualization tool（http：/jsp.weigelworld.or）和genevestigator expression data（https：/），以基因表

6、達(dá)改變量為1.5倍為閾值，篩選對iqm4基因表達(dá)影響較大的非生物因素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。2.3 非生物脅迫的處理滲透脅迫處理：將1/2 ms固體培養(yǎng)基上生長2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，稱取3050mg幼苗為一個樣品，共稱取6個樣品；將樣品浸沒于300mmol/l甘露醇溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。鹽脅迫處理：稱取6個2周幼苗樣品，將樣品浸沒于150mmol/l氯化鈉溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。低溫處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品置于4處理，分別在0.5、1和3h取樣。脫水處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品放在濾紙上，并置于長日照培

7、養(yǎng)室中，分別在0.5、1和3h取樣。損傷處理：先用帶有鋸齒的鑷子夾傷生長在培養(yǎng)基上的2周幼苗，然后置于長日照培養(yǎng)室中，分別在0.25和0.3h取樣。2.4 iqm4基因的rt-pcr分析參照rnaiso plus說明書提取非生物脅迫處理的樣品總rna。以iqm4編碼序列的特異引物f1：5-agttagctc ttcagcattggc-3和r1：5-tcttcttgttcctctgtaacg-3進(jìn)行半定量rt-pcr，分析樣品中iqm4的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)以擬南芥-atpase基因設(shè)計(jì)了內(nèi)標(biāo)引物f2：5-ctgaatcaatctcttaagctg-3和r2：5-gtgcaga aagttctacag

8、aactac-3。rt-pcr采用primescript one step rt-pcr kit，每個反應(yīng)以100 ng總rna為模板，總反應(yīng)體積為20 l，擴(kuò)增參數(shù)為50 30min，94 2min，94 30s，54 30s，72 40s， 31次循環(huán)，72 5min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。3 結(jié)果與分析3.1 生物信息數(shù)據(jù)庫中iqm4基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析 本文以擬南芥iqm4為研究對象，檢索了兩個數(shù)據(jù)庫，搜索到大量iqm4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)資料。表1是以iqm4表達(dá)量改變倍數(shù)在1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，整理了幼苗地上組織中iqm4基因表達(dá)受到

9、鹽和滲透脅迫、低溫、脫水以及機(jī)械損傷等非生物脅迫因子影響的數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)庫的資料（表1）來分析，鹽脅迫1h后明顯抑制了幼苗地上組織中iqm4基因表達(dá)；滲透脅迫在0.51h內(nèi)顯著增強(qiáng)了iqm4基因表達(dá)量，但324h內(nèi)基因表達(dá)變化不明顯；低溫脅迫0.5h內(nèi)iqm4基因表達(dá)量有所下調(diào)；脫水和機(jī)械損傷能迅速增強(qiáng)iqm4基因表達(dá)量。3.2 幼苗中iqm4基因的rt-pcr分析采用半定量rt-pcr技術(shù)分析幾種非生物脅迫對擬南芥幼苗中iqm4基因表達(dá)的影響。從圖1a可以看出，與對照相比，鹽脅迫初期（0.5和1h），iqm4基因表達(dá)明顯上調(diào)，隨著鹽脅迫時間的增加（6和12h），iqm4表達(dá)量顯著降低，但24h

10、后表達(dá)量恢復(fù)到對照水平。圖1b顯示，與對照相比較，滲透脅迫0.512h期間iqm4表達(dá)量逐漸降低，至24h時表達(dá)量有所增加，但仍低于對照水平。圖1c顯示脫水處理能增強(qiáng)幼苗中iqm4基因表達(dá)量。圖1d顯示低溫處理后，iqm4表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低（0.51h）后升高（3h）趨勢，低溫處理3h后iqm4表達(dá)量明顯高于對照。圖1e顯示幼苗遭受機(jī)械損傷0.25h后，iqm4基因表達(dá)稍有增強(qiáng)，而0.5h后，iqm4基因的表達(dá)量急劇降低。從rt-pcr結(jié)果來看，不同脅迫因子對幼苗中iqm4基因表達(dá)水平產(chǎn)生了不同影響。4 討論已知擬南芥iqm家族在植物對光、生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用7。半定量rt-pc

11、r結(jié)果驗(yàn)證了生物信息數(shù)據(jù)庫的資料，結(jié)果表明擬南芥iqm4基因表達(dá)受到鹽和滲透脅迫、脫水、低溫和機(jī)械損傷等非生物脅迫因子的影響，初步證明iqm4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rt-pcr分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)有部分偏差，如鹽脅迫處理rt-pcr結(jié)果是脅迫0.5h和1h后iqm4基因表達(dá)明顯上調(diào)，而數(shù)據(jù)庫的資料則為脅迫1h后iqm4表達(dá)量顯著降低。rt-pcr結(jié)果顯示滲透脅迫明顯抑制iqm4表達(dá)，而數(shù)據(jù)庫的資料則為滲透脅迫0.5h和1h后顯著增強(qiáng)iqm4基因表達(dá)量。數(shù)據(jù)庫的資料顯示機(jī)械損傷明顯增強(qiáng)iqm4表達(dá)水平，但rt-pcr結(jié)果則是表達(dá)水平有所下降。我們推測rt-pcr結(jié)果與數(shù)據(jù)

12、庫的資料出現(xiàn)偏差的原因可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料的取樣部位不一致造成的，數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的取材為幼苗地上組織，而本實(shí)驗(yàn)是以整株幼苗為實(shí)驗(yàn)材料?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1韋慧彥，郭振清，崔素娟.鈣不依賴性鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展j.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34（2）：124-131.2田長恩，周玉萍.植物具iq基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展j.植物學(xué)報(bào)，2013，48（4）：447-460.3zhou yp， duan j， yamamoto kt， tian ce. atiqm1， a novel calmodulin-binding protein， is involved in stomatal movement in arabidopsisj. plant molecular biology， 2012， 79（5）： 333-346.4周玉萍，陳瓊?cè)A，陳潔珊，程惠貞，田長恩.iqm1基因過量表達(dá)對擬南芥氣孔運(yùn)動及根系生長的影響j. 西北植物學(xué)報(bào)，2013，33