大腸桿菌質(zhì)粒提取

1、一、大腸桿菌質(zhì)粒 DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但提取方法有很多種， 以下介紹一種最常用的方法：堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒 DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：1、 接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培 養(yǎng)基。2、37 C振蕩培養(yǎng)過夜。3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min ,棄上清液。4、 加 0.lml 溶液 I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0 , 25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。5、 加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH ,

2、 1% SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。6、 加入0.15m 1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc , pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。7、以10, 000rpm離心20min,取上清液于另一新 Ep管8、 加入等體積的異戊醇，混勻后于？0C靜置10min。9、再以10, 000rpm離心20min,棄上清。10、用70%乙醇0. 5ml洗滌一次，抽干所有液體。11、待沉淀干燥后，溶于 0. 05mlTE緩沖液中二、質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，應(yīng)選用電泳純的，瓊脂糖此級產(chǎn)品篩除了抑制物和核酸酶，而且用漠化乙錠染色后熒

3、光背景最小。(1) 瓊脂糖凝膠電泳裝置由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應(yīng)性又強(qiáng)，在過去 15年里已成功地設(shè)計(jì)了形形 色色及大大小小的電泳槽。 對這些裝置的選擇主要是依據(jù)個(gè)人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠。水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中， 則可將凝膠直接鋪在平臺上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進(jìn)行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有相當(dāng)一部分的電流將通過凝膠的全長。(2) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形

4、成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電場接通后，在中性pH值下帶負(fù)電荷的 DNA向陽極遷移。(3) 瓊脂糖凝膠的染色電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含EB的染液中，染色10分鐘，取出紫外燈下觀察。三、大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)的細(xì)胞可以攝入外部溶液中的DNA ,而常態(tài)的細(xì)胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。1、 取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37 C振蕩培養(yǎng)過夜2、 取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37C振蕩培養(yǎng) 3h至OD600=0.33、 然后把培養(yǎng)物倒入 1.5ml離心管

5、中，冰浴10min。4、在4C下以4000rpm離心5min,去上清液5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上 30min6、然后再在4C下以4000rpm離心10min,去上清液7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置 4-12hr備用。四、質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備好感受態(tài)細(xì)胞后，接下來就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞的過程。但要注意的是感受態(tài)細(xì)胞最好是新制備的，因?yàn)楸４嬉欢〞r(shí)間的感受態(tài)細(xì)胞會使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。1、取新制備的一管感受態(tài)細(xì)胞。2、取0. 03ml感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)和 4ng質(zhì)粒DNA混勻，置冰浴 30min3

6、、將Ep管置于42 C水浴中熱沖擊 2分鐘，立即置于冰上 1分鐘。4、在 Ep管中加70u1 LB培養(yǎng)基混勻，37C培養(yǎng)30min5、 涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上。6、37 C培養(yǎng)過夜，長出的菌斑既為陽性克隆。五、線形質(zhì)粒 DNA 5'-粘性末端去磷酸經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒DNA 5'端均帶有磷酸集團(tuán)，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此一般酶切的質(zhì)粒DNA要經(jīng)脫磷，使用堿性磷酸酶（CIAP）去除5'端磷酸集團(tuán)。方法如下： 1、質(zhì)粒 DNA 和 CIAP 以及 BUFFER 37 C水浴 30min2、補(bǔ)充 CIAP 再37

7、 C水浴30min3、加入50mM EDTA至終濃度 5mM 75 C加熱10min失活CIAP4、冷卻至室溫，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮。5、抽干溶液，加適量 TE溶解。六、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR是一種選擇性體外擴(kuò)增 DNA或RNA片段的方法。其特異性是由兩個(gè)人工合成的 引物序列決定的。所謂引物就是與待擴(kuò)增 DNA片段兩翼互補(bǔ)的寡聚核昔酸， 其本質(zhì)是ssDNA 片段。待擴(kuò)增DNA模版加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復(fù)性。此時(shí)，兩引物的3'端相對，5'向背。在合適的條件下，由 Taq DNA聚合酶催化引物引導(dǎo)的DNA合成，既引物的延伸。上述過程是由溫

8、度控制。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)。PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。理論上擴(kuò)增產(chǎn)物量成指數(shù)上升，既n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為 2n拷貝。典型的PCR操作過程如下： 1、反應(yīng)體系：體積成分工作液濃度終濃度14.0 hPCR Water2.5偵10X Taq Buffer10X1X1.5偵MgCl225 mM1.5 mM4.0偵*dNTP Mix1.25 mM each dNTP0.2 mM each dNTP0.25 hPrimer 1100 pmoles/ 11 M0.25 hPrimer 2100 pmoles/ (11 M0.25 hTaq DNA Polymerase5 U/ l0.05 U/ l i2.5偵DNA25 (lTotal Reac