免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析篩選相互作用蛋白

1、具體步驟：1 免疫共沉淀( Co-immunoprecipitation )(1) 培養(yǎng) HEK293FT 細(xì)胞至 90%匯集，將 pCMV-Myc-AP-2 3用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入 HEK293FT 細(xì)胞中。磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法 :a. 在轉(zhuǎn)染前一天，對(duì)于 100mm培養(yǎng)皿，每皿用10m1不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。b. 轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞密度最好達(dá)到90-95%，吸掉舊培養(yǎng)液，PBS漂洗一次，換成l0mL無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液。c. 將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同CaCl2混合制成CaC-DNA溶液；d. 在不斷攪拌振蕩過(guò)程中，逐滴緩緩地加入到HEPES-磷酸鈣溶液中去，形成一種磷酸鈣-DNA共沉淀；e.

2、 將磷酸鈣-DNA復(fù)合物滴加入細(xì)胞中，輕輕混勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。f. 磷酸鈣-DNA復(fù)合物與細(xì)胞接觸時(shí)間為 4-6 h后，換成有血清和抗生素的培養(yǎng)液。(2) 繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用1 x PBS懸浮細(xì)胞并用細(xì)胞刮收集細(xì)胞。(3) 在4 C條件下500 g離心23min，棄上清沉淀用 RIPA緩沖液重懸。(4) 細(xì)胞于-80C快速冷凍15min，然后于37C快速融解15min。重復(fù)兩次。(5) 細(xì)胞裂解液超聲 80秒后在4C條件下12000 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新管 中，每管取出一部分做 Western Blot 檢測(cè)，其余的一半加入抗 Myc 的多抗，另一半加入免 疫前血清做陰性

3、對(duì)照，反應(yīng) 4h.(6) 加入 protein-A/G 耦連珠子繼續(xù)在室溫反應(yīng) 6h 或過(guò)夜 .(7) 在4 C條件下500g離心2 min，棄上清珠子用裂解緩沖液重懸。重復(fù)三次。(8) 在第四次洗滌后，珠子用 20 u L的加樣緩沖液重懸，105 C加熱5min.(9) 進(jìn)行 10%的 SDS/PAGE 電泳后，將蛋白膠進(jìn)行銀染。2 蛋白銀染和質(zhì)譜分析樣品的制備2.2.3.1 蛋白銀染 電泳結(jié)束后 ,將膠小心取下 ,雙蒸水洗兩次 ,然后進(jìn)行凝膠染色，銀染方法如下：1. 固定液固定 2h 或者過(guò)夜。2漂洗液漂洗20min,三次3. 敏壓液敏壓 2min.4雙蒸水漂洗5min,三次。5. 銀染液

4、銀染 30min.6. 雙蒸水漂洗 1min,2 次。7. 加入顯色液顯色 510min.8. 終止液終止。9. 雙蒸水漂洗干凈，置雙蒸水中保存。3 質(zhì)譜分析樣品的制備 :從膠中切取分辨較好的 4蛋白質(zhì)帶 , 置于 1.5 ml Eppendorf 管中 ,對(duì)染色的蛋白質(zhì)帶分 別進(jìn)行脫色、還原、烷基化、酶解、萃取等處理 , 將制備好的樣品用于質(zhì)譜分析 .銀染蛋白質(zhì)點(diǎn)酶解步驟1. 水洗：雙蒸水漂洗銀染后的膠，搖床上洗2-3 次，每次 10min.2. 成像，取點(diǎn)：膠做完后即掃描，然后取點(diǎn)。3. 脫色，水洗：脫色工作液： 30mmol/L K 3Fe（CN） 6:100mmol/L Na 2S2O

5、3=1：14. 加 50% 乙晴，震蕩，洗 1-2 次，每次 15min.5脫水： 100%乙晴脫水至膠塊成白色， 諾是震蕩后一次反應(yīng)膠塊沒(méi)有變白， 可將乙晴吸出， 再加入 100% 乙晴脫水一次。6.吸漲：加入25mM的NH4HCO3震蕩后靜置吸脹5 min，再吸出。7脫水：同步驟 5。8. 凍干：用封口膜封口，扎孔，凍干機(jī)中凍干20min,取出時(shí)輕敲EP管底，其中白色膠塊在管中輕快跳躍即可。9. 還原：加還原劑，封口。57 度水浴一小時(shí)。還原劑：25mM的NH4HCO3 （含10mM二硫蘇糖醇 DTT）10. 烷基化：從水浴鍋中取出樣品后，室溫冷卻，去掉過(guò)量的液體，迅速加入同體積的烷基 化

6、試劑室溫暗處放置 30min.烷基化試劑：25mM的NH4HCO3 （含55mM吲哚乙酸IAA ）。11. 終止烷基化反應(yīng)，洗掉 IAA .用25mM的NH4HCO3洗膠塊兩次。12. 脫水：同步驟 5 。13. 吸脹：加入25mM的NH4HCO3，震蕩，靜置5 min,吸出。14. 脫水：同步驟 5 。15凍口：凍干機(jī)中凍干 30min，完全凍干。16. 加酶：加適量酶液（切膠儀切的膠塊每管加入4ul 酶液），冰上放 30min.酶液的配制：將酶液用覆蓋液（10%乙晴，25mM的NH4HCO3）稀釋到0.02ug/ul。17. 檢查酶液吸脹情況，多余的酶吸走，酶液不夠，即膠塊中還有白色，則加

7、入適量的酶液。18. 加覆蓋液 20ul 封口， 37度保溫 16-18小時(shí)。蛋白質(zhì)酶解后蛋白用品的提取19. 將樣品從 37 度水浴鍋中取出后， 10000g2 min.20. 將上清轉(zhuǎn)移到洗干凈的 EP 管中，21. 剩余膠塊中加入萃取液（ 2.5%三氟乙酸， 67%乙晴 for MALDI ） ,37 度保溫 3min.22. 超聲15min,間隔5 min重復(fù)超聲15min，水溫不超過(guò) 40度。23.10000g2 mi n,合并上清。24.冷凍離心干燥至 2-5ul 供質(zhì)譜檢測(cè)。4 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 : 制備好的樣品送到湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)室，使用美國(guó) BRU KER 公司

8、的 ProFlexTM III MALDI-TOF 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析 ,獲得的混合物肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)通過(guò)借助 Micromass 公司配備的專用軟件 MASseq 直接推導(dǎo)出肽段序列 , 再用推斷的序列與肽段質(zhì) 量相結(jié)合 , 查詢數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定 .附錄 : 銀染方法1. 固定液固定 2h 或者過(guò)夜。2. 漂洗液漂洗 20min, 三次3. 敏壓液敏壓 2min.4. 雙蒸水漂洗 5min, 三次。5. 銀染液銀染 30min.6. 雙蒸水漂洗 1min,2 次。7. 加入顯色液顯色 510min.8. 終止液終止。9. 雙蒸水漂洗干凈，置雙蒸水中保存。 試劑配方：1固定液：甲醇 200ml

9、，乙酸48ml,去離子水152ml，甲醛200ml .2漂洗液：無(wú)水乙醇 173ml,去離子水327ml。3敏壓液：五水硫代硫酸鈉0.137g，去離子水400ml。4 銀染液：AgNO 3 0.05-0.1g,甲醛 10-20ul,去離子水 25ml.5顯色液：Na2CO3 1.5g，甲醛10ul,敏壓液350ul,去離子水25ml.6終止液：甲醛 200ml,乙酸48ml,去離子水152ml.銀染蛋白質(zhì)點(diǎn)酶解步驟：1水洗：雙蒸水漂洗銀染后的膠，搖床上洗 2-3 次，每次 10min.2 成像，取點(diǎn)：膠做完后即掃描，然后取點(diǎn)。3 脫色，水洗：脫色工作液： 30mmol/L K 3Fe（CN）6

10、:100mmol/L Na 2S2O3=1： 14. 加 50%乙晴，震蕩，洗 1-2 次，每次 15min.5脫水： 100%乙晴脫水至膠塊成白色，諾是震蕩后一次反應(yīng)膠塊沒(méi)有變白，可將乙 晴吸出，再加入 100%乙晴脫水一次。6.吸漲：加入25mM的NH4HCO3震蕩后靜置吸脹5 min，再吸出。 7脫水：同步驟 5。8. 凍干：用封口膜封口，扎孔，凍干機(jī)中凍干20min,取出時(shí)輕敲EP管底，其中白色膠塊在管中輕快跳躍即可。9. 還原：加還原劑，封口。57 度水浴一小時(shí)。還原劑：25mM的NH4HCO3 （含10mM二硫蘇糖醇 DTT）1 0 .烷基化：從水浴鍋中取出樣品后，室溫冷卻，去掉過(guò)

11、量的液體，迅速加入同體積的烷基化試劑室溫暗處放置30min. 烷基化試劑： 25mM 的NH4HCO3 （含 55mM 吲哚乙酸 IAA）。11. 終止烷基化反應(yīng)，洗掉 IAA .用25mM的NH4HCO3洗膠塊兩次。12. 脫水：同步驟 5 。13. 吸脹：加入25mM的NH4HCO3，震蕩，靜置5 min,吸出。14. 脫 水：同步驟 5 。15. 凍口：凍干機(jī)中凍干 30min，完全凍干。16. 加酶：加適量酶液（切膠儀切的膠塊每管加入4ul酶液），冰上放30min.酶液的配制：將酶液用覆蓋液（10%乙晴，25mM的NH4HCO3）稀釋到0.02ug/ul。17. 檢查酶液吸脹情況，多余的酶吸走，酶液不夠，即膠塊中還有白色， 則加入適量的酶液。18. 加覆蓋液20ul封口，37度保溫16-18小時(shí)。，蛋白質(zhì)酶解后蛋白用品的提取1. 將樣品從 37 度