利用大醬中的枯草芽孢桿菌提高人參中Rg3含量的研究

1、    利用大醬中的枯草芽孢桿菌提高人參中rg3含量的研究    李鉉軍，張先，付長雪，李范洙摘要：為探究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參對人參內(nèi)稀有皂苷rg3含量的影響，本實(shí)驗(yàn)首先以七葉苷修飾過的lb營養(yǎng)瓊脂為選擇培養(yǎng)基，從大醬中分離得到的200株枯草芽孢桿菌菌株中篩選出10株產(chǎn)葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌。然后用pnpg法分別測得10種菌種產(chǎn)-葡萄糖苷酶的酶活力，選取酶活力最高的58號菌進(jìn)行培養(yǎng)，并對58號菌的最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，得到58號菌的最佳培養(yǎng)時間為16 h，最適產(chǎn)酶溫度36，最適產(chǎn)酶ph值6.0，最佳產(chǎn)酶時間8 h。在最適條件下，用58號菌對雙螺桿擠

2、壓后的人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以白參為參照。結(jié)果表明在第4d時，白參內(nèi)rg3含量最高，為0.6236 mg/g，比發(fā)酵前提高了53.75%。在第4d時，雙螺桿擠壓后的人參內(nèi)rg3含量最高，為0.8442 mg/g，比發(fā)酵前提高了70.99%。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；人參；rg3： r284.1 ： a doi編號： 10.14025/ki.jlny.2018.18.026人參為五加科人參屬多年生草本植物。是一種傳統(tǒng)的名貴中草藥，在我國具有悠久的藥用歷史，被譽(yù)為“百草之王”。神農(nóng)本草經(jīng)是現(xiàn)存最早的中藥學(xué)專著，據(jù)其記載人參具有“補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目益智，久服輕身延年”之功效。人參中

3、的主要活性成分之一是人參皂苷，已知的人參皂苷有40余種。白參中含量最高的人參皂苷為rb1、rb2、rd、rg1、re、rf等1。紅參含量高的二醇類皂苷rb1、rb2、rc、rd 等， 加工過程中轉(zhuǎn)化為rg3 、rg5、rh2、rh3 等稀有皂苷；含量高的三醇類皂苷rg1、re、rf 等， 轉(zhuǎn)化為rg2、rg4 、rh1、rh4 等稀有皂苷2。這些稀有皂苷具有很高的生理活性，尤其在抗腫瘤方面顯示了獨(dú)特的作用，但是其人參內(nèi)含量普遍很低。為此，本實(shí)驗(yàn)致力于研究微生物法固態(tài)發(fā)酵人參以增加其內(nèi)稀有皂苷rg3、rd的含量。多年來，各國科學(xué)研究者圍繞人參單體皂苷制備，從化學(xué)法3、組織培養(yǎng)法、人參發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)

4、法、酶法4、微生物發(fā)酵法等方面進(jìn)行了探索，并在某些方面取得了進(jìn)展，但目前大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段。微生物發(fā)酵是利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種酶將外源底物進(jìn)行催化使其轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的經(jīng)濟(jì)價值更高的產(chǎn)物，這是物理或化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的生化反應(yīng)。微生物發(fā)酵法主要包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。液體發(fā)酵是將底物人參皂苷從生藥中提取出來，在液體環(huán)境下利用微生物產(chǎn)生水解酶進(jìn)行的發(fā)酵方法。固體發(fā)酵工藝是指在幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固體基質(zhì)中，用一種或多種微生物發(fā)酵的生化反應(yīng)過程5。人參皂苷的固體發(fā)酵是將人參等中藥材作為營養(yǎng)基質(zhì)，通過微生物的生理活動與生化反應(yīng)過程對人參皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生新的生物

5、活性成分和新的功能。這是一個雙向發(fā)酵的過程。具有活性成分的藥性基質(zhì)被微生物發(fā)酵，提供微生物維持生命所需的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)菌體生長分裂。同時又能因菌體代謝產(chǎn)生的酶而改變?nèi)藚⒃碥盏脑薪Y(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有人參皂苷。近年研究者開始將藥用真菌或食用細(xì)菌作為發(fā)酵菌株對人參進(jìn)行雙向發(fā)酵。無須將微生物與發(fā)酵產(chǎn)物分離，二者共同發(fā)揮藥物活性，克服了其他皂苷轉(zhuǎn)化方法分離純化困難、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。工藝簡單，質(zhì)量易于控制，次級人參皂苷含量豐富，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)原料為白參和雙螺桿擠壓后的人參，所用菌種來自于從朝鮮族大醬中提取出的200株枯草芽孢桿菌。1.2 試劑與藥品對硝基苯基-d-

6、吡喃葡萄糖苷（上海晶純生化科技股份有限公司）；七葉苷（上海源葉生物科技有限公司）；lb營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；lb營養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；其余乙酸、乙酸鈉、對硝基苯酚、碳酸鈉，無水正丁醇，無水甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。1.3 試驗(yàn)儀器sw-cj-1fd 超凈工作臺（上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司）；sx-700 高壓蒸汽滅菌鍋（日本tomy公司）；nu-9668e 超低溫冷凍箱（美國nuaire公司）；ja-3100 精密電子天平（深美儀器有限公司）；fa1004 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；dhg-907385- 電熱恒溫鼓風(fēng)干

7、燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；kq-500de 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；hh-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；tdl-5000b 冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；dzf-6050 真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；shb-a 循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司）；uv-1800 紫外/可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；40目網(wǎng)篩。1.4 菌種的活化和篩選1.4.1 枯草芽孢桿菌的活化：采用劃線法6 制作平板在超凈工作臺中將滅菌后的lb營養(yǎng)趁熱傾倒在無菌培養(yǎng)皿中。水平在滅菌后的工作臺上，冷凝后加蓋保存；菌體培養(yǎng)：將2

8、00株菌種從冷藏箱中取出后，在超凈工作臺中劃線接入平板中，在37培養(yǎng)24h于恒溫培養(yǎng)箱中；菌種活化：將200個菌種繼代培養(yǎng)3次，進(jìn)行純化。1.4.2 產(chǎn)-葡萄糖苷酶菌株的篩選 將200株枯草芽孢桿菌分別接種在添加了七葉苷和檸檬酸鐵的lb營養(yǎng)瓊脂平板中，在37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。七葉苷顯色的原理為：七葉苷在-葡萄糖苷酶的作用下能夠水解為七葉苷元（6，7-二輕香豆素）和葡萄糖，當(dāng)七葉苷元遇到游離的鐵離子時會產(chǎn)生黑色物質(zhì)7-8。借此篩選出能夠產(chǎn)生葡糖苷酶的菌株。1.4.3 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取對硝基苯酚1.39mg，溶解于蒸餾水中并定容至100ml。取 6個10ml容量瓶，分別吸取

9、 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml 對硝基苯酚溶液至 16 號瓶，用蒸餾水定容并混勻。則16 號瓶對應(yīng)的對硝基苯酚濃度為0.01mmol/l、0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.04mmol/l、0.05mmol/l、0.06mmol/l。分別取不同濃度的對硝基苯酚溶液2ml，再加入1ml 1mol/l碳酸鈉溶液充分混勻，以蒸餾水為對照，紫外分光光度計在40nm的條件比色記錄值，橫坐標(biāo)為對硝基苯酚的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.4 -葡萄糖苷酶活性測定 -葡萄糖苷酶活性測定采用pnpg法9-10，pnpg法是以對硝基苯酚-葡萄糖苷為底物，-葡萄糖苷酶可以在酸性條件下使其

10、水解生成對硝基苯酚，對硝基苯酚在堿性條件下為黃色，后用比色法測定并計算出-葡萄糖苷酶活力。取0.1ml粗酶液，加入0.9ml ph 5.0的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，于37水浴預(yù)熱，10分鐘后加入已預(yù)熱10 min的1ml 5 mmol/l pnpg溶液，精確計時10min后立即加入1ml 1mol/l 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，室溫放置5min冷卻，于400nm處測吸光值od。以加熱失活的酶液為空白對照。在此條件下，酶的活性（u）被定義為酶每分鐘分解pnpg 釋放出 1 mol 對硝基苯酚所需要的酶量。1.5 枯草芽孢桿菌酶學(xué)性質(zhì)研究11-121.5.1 枯草芽孢桿菌生長曲線的確定 將

11、枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)12h后，制成種子液。吸取1ml種子液接種于裝有50ml lb肉湯的錐形瓶中，搖勻后置于37培養(yǎng)24h，以未接種的培養(yǎng)基為空白對照，每隔4h在600nm處測定培養(yǎng)液的吸光度值。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制枯草芽孢桿菌生長曲線。1.5.2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)時間的確定分別吸取1ml種子液于8組裝有25ml lb肉湯的錐形瓶中搖勻，ph自然，密封在37條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)。分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時，將培養(yǎng)液于無菌離心試管中，在4000 r/min下離心10min，制得粗酶液，測定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。1.5.3 枯

12、草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)ph的確定分別吸取1ml種子液于9組裝有25ml lb肉湯的錐形瓶中，調(diào)節(jié)lb肉湯ph值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在37條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。后將培養(yǎng)液于無菌離心試管中，在4000r/min下離心10min，制得粗酶液，測定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。1.5.4 枯草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)溫度的確定分別吸取1ml種子液于6組裝有25ml lb肉湯的錐形瓶中，ph自然，在28、31、34、37、40、43下?lián)u床培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液于無菌離心試管中，在4000r/min下離心10min，制得粗酶液，

13、測定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。1.6 人參固態(tài)發(fā)酵及稀有皂苷測定1.6.1 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參 取活化后的枯草芽孢桿菌1ml接種至20ml lb肉湯培養(yǎng)基中，以36、150rpm/min條件下恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，制成種子液；將雙螺桿擠壓后的人參和白參粉碎后過40目篩；取過篩后的人參4g加5ml lb肉湯培養(yǎng)基混合均勻后置于高壓滅菌鍋中，滅菌處理；冷卻后，加入0.25ml種子液，密封后置于36恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，每隔24h測定一次人參皂苷；實(shí)驗(yàn)分為十組，雙螺桿擠壓后的人參五組，白參五組，各組三個平行。1.6.2 稀有人參皂苷rg3的提取與檢測13-17將發(fā)酵后的人參從培養(yǎng)箱中取出

14、，干燥后，研磨成均勻顆粒大小，過40目篩；稱取2g發(fā)酵人參粉放入平底燒瓶，加入80%甲醇溶液，在80下回流提取3h，取上清液，此操作重復(fù)兩次；所得提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收甲醇（溫度不超過60）；減壓回收后，浸膏掛于燒瓶內(nèi)部，加20ml蒸餾水溶解；所得水溶液再加20ml水飽和正丁醇溶液，置于離心管中；在4000rpm下離心萃取10min，重復(fù)三次，取上清液并合并；將所得上清液在60下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓回收正丁醇液，蒸干后殘留物即為總皂苷粗品；在旋干后的燒瓶中加入2ml甲醇溶液溶解，過濾，得待測樣品；hplc法18測定皂苷含量。2 結(jié)果與分析2.1 產(chǎn)-葡萄糖苷酶的菌株篩選在枯草芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)-葡萄

15、糖苷酶的菌株篩選時，菌落周圍出現(xiàn)黑色水解斑的菌株為最終的目的菌。篩選結(jié)果如下圖 1 所示，200株中有10株產(chǎn)-葡萄糖苷酶。結(jié)果如圖1所示，200株枯草芽孢桿菌中在七葉苷選擇培養(yǎng)基下共篩出10株顯色菌株，1、58、153三株顯色較深，其余6株顯色較淺，剩余191株不顯色。2.2 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)1.4.4中的方法，酶活力計算公式為：u=c×n/（10×0.1）注：u：酶活力（iu/ml） 10：反應(yīng)時間（min）n：原酶液稀釋倍數(shù) 0.1：添加酶液體積（ml）c：對硝基苯酚含量，為對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的值，見圖2。根據(jù)上圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

16、為：y=10.834x+0.0155，相關(guān)系數(shù) r2=0.9989（y為對硝基苯酚的吸光度，x為對硝基苯酚的濃度）。2.3 不同菌株產(chǎn)-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果對10株篩選后的菌株進(jìn)行-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果如圖3所示：由圖3可知，第58號菌株為產(chǎn)-葡萄糖苷酶活力最高的菌株，因此選擇58號菌為人參固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵菌株。2.4 枯草芽孢桿菌酶學(xué)性質(zhì)研究2.4.1 枯草芽孢桿菌的生長曲線由圖4可知，58號枯草芽孢桿菌在48h為生長對數(shù)期，繁殖速度最快；在12h后趨于穩(wěn)定，此時繁殖速度與死亡速度幾乎持平；而16h后，由于營養(yǎng)物質(zhì)及生長空間的匱乏，細(xì)菌數(shù)急速下降，繁殖速度滯后，死亡率升高。2.4.2 培養(yǎng)

17、時間對枯草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶的影響 由于酶的產(chǎn)量會受菌液培養(yǎng)時間長短的影響，所以在37下，對菌液進(jìn)行恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)。分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時，對菌液進(jìn)行搖勻離心，測定其酶活力，以最高酶活100%計算。結(jié)果如圖5所示：由圖5可知，枯草芽孢桿菌在04h時酶活力緩慢增加；48h時產(chǎn)酶量迅速增加，酶活力增長速度快；在8h時達(dá)到產(chǎn)酶量的峰值；繼續(xù)培養(yǎng)后，酶活性開始逐漸下降。2.4.3 ph值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶的影響 不同來源菌株其最適ph值是不同的，只有在特定的ph值范圍內(nèi)才會表現(xiàn)出最大活性，即為所謂的最適ph值。在不同ph值條件下對菌液進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，測定酶活

18、力。酶活以最高100%計算。結(jié)果如圖6所示：由圖6所知，菌株在ph為7.0時，酶活力最強(qiáng)。在ph值低于7.0的條件下，酶活性隨著ph值的提高而增強(qiáng)；在ph值高于7.0的情況下，酶活性隨著ph值的升高而減弱。2.4.4 溫度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶的影響 每一種酶在一定條件下，只在某一特定溫度時才表現(xiàn)出最大的活性，即所謂的最適溫度。溫度和ph值對酶的活性的影響是相互依賴的9。所以，反應(yīng)必須控制在恒溫條件下進(jìn)行，且所有試劑應(yīng)預(yù)熱到所需要的溫度。本實(shí)驗(yàn)將菌液ph調(diào)至7.0，分別考察菌液在28、31、34、37、40、43下酶活力的變化。酶活以最高為100%計算。結(jié)果如圖7所示：由圖7所知，菌株在

19、反應(yīng)溫度為37時，酶活性達(dá)到峰值。在低于此溫度條件下，酶活性隨著反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)；在高于此溫度條件時，酶活性則隨著反應(yīng)溫度的升高而減弱。2.5 人參內(nèi)稀有皂苷rg3的含量及分析為了研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參對人參內(nèi)稀有皂苷rg3含量的影響，在發(fā)酵菌最適產(chǎn)酶條件下，對處理后的人參粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并且每隔24h對其進(jìn)行稀有皂苷含量的測定，最終比較人參發(fā)酵前后人參內(nèi)rg3含量的變化情況。本實(shí)驗(yàn)采用hplc法測量rg3的含量，原料為雙螺桿擠壓后的人參，白參為對比參照。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖8所示：由表1和圖8可得，雙螺桿擠壓后的人參中rg3的含量一直高于普通白參，未發(fā)酵時提高了20.56%，發(fā)酵

20、后提高了35.38%，說明雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵時更有利于rg3的生成，從而導(dǎo)致在發(fā)酵后rg3含量增加。由表1和圖8可知，雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵第四天時，rg3含量最高，相比較發(fā)酵前rg3含量提高70.99%。雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵的第14d，rg3的含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，在第四天含量達(dá)到峰值，從第五天開始，rg3的含量開始隨時間增加而減少。白參同樣在發(fā)酵的第四天時，rg3含量到達(dá)峰值，與發(fā)酵前含量相比較提高了58.75%。白參內(nèi)rg3含量在發(fā)酵的14d呈上升趨勢，第五天開始有所下降。人參在發(fā)酵過程中均出現(xiàn)了發(fā)酵的12d時rg3含量低于未發(fā)酵時，經(jīng)過2d發(fā)酵后，人參內(nèi)rg3含量開

21、始急速上升直至超過發(fā)酵前人參內(nèi)rg3含量的現(xiàn)象。在王洪峰20等對人參雙向發(fā)酵過程中總皂苷和總多糖含量的研究中，人參皂苷rb1的c20位置處的糖苷鍵會在發(fā)酵過程水解斷裂變成rg3，從而使rg3含量增加。陳13等在枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參總苷為rg3的研究中提出-葡萄糖苷酶水解人參皂苷rb1 c20位點(diǎn)處的葡萄糖苷，形成rg3和1分子葡萄糖，最終使rg3含量增加。對于發(fā)酵第1天出現(xiàn)rg3含量低于發(fā)酵前的情況，猜測發(fā)酵前期細(xì)菌生長需要大量營養(yǎng)物，rg3可能出現(xiàn)逆水解反應(yīng)生成營養(yǎng)物以供細(xì)菌的生長繁殖；細(xì)菌數(shù)穩(wěn)定后，-葡萄糖苷酶開始發(fā)揮作用，此時rg3含量開始快速增加，即發(fā)酵24d；隨著細(xì)菌數(shù)的增加，營養(yǎng)物

22、質(zhì)減少，細(xì)菌內(nèi)部出現(xiàn)競爭生長，此時可能又會出現(xiàn)rg3的逆水解反應(yīng)，rg3開始減少，細(xì)菌所需營養(yǎng)物有所增加，即出現(xiàn)發(fā)酵第五天rg3含量開始下降的現(xiàn)象。3 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)從200株枯草芽孢桿菌中篩選出10株產(chǎn)-葡萄糖苷酶的菌株，隨后使用pnpg法分別測得此10個菌株的酶活力，并從中選取酶活力最高的58號菌株為最終發(fā)酵菌株。然后，對58號菌進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，得出58號菌在培養(yǎng)8h后-葡萄糖苷酶活性達(dá)到最高，產(chǎn)酶最適ph值為7.0，最適溫度為37。在枯草芽孢桿菌最適產(chǎn)酶條件下，對人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，最終得到在發(fā)酵第四天時，雙螺桿擠壓后的人參和白參中rg3含量達(dá)到最高。發(fā)酵后，雙螺桿擠壓后的人參內(nèi)rg3含量

23、提高了70.99%，白參內(nèi)rg3含量提高了53.75%。且發(fā)酵前，人參經(jīng)雙螺桿擠壓后rg3含量提高了20.56%；發(fā)酵后，雙螺桿擠壓后的人參相較于白參rg3含量提高了35.38%。實(shí)驗(yàn)證明，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵法提高了人參內(nèi)稀有皂苷rg3含量。參考文獻(xiàn)1王鐵生.中國人參m.沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2001，671-695.2陳業(yè)高，呂瑜平，桂世鴻等.三七葉甙制備原人參二醇及其差向異構(gòu)體j.精細(xì)化工，2003，20（07）：425-426.3劉娜，樸虎日，趙余慶.稀有抗腫瘤人參皂苷衍生物的制備與分離中草藥，2009，32（05）：707-709.4姜彬慧，韓穎，趙余慶，等.酶轉(zhuǎn)化三七葉總苷制備

24、人參皂苷c-k的工業(yè)優(yōu)化.中草藥，2004，35（09）：986-988.5王興紅，李祺德.微生物發(fā)酵中藥應(yīng)成為中藥研究的新內(nèi)容j.中草藥，2001，32（03）：112-116.6dai chun-chao，yuan sheng， shi yang. effect of strain storing and reculturing conditions on the cephalosporium sp. mycelium's fatty acid composition. food science.2004，25（03）：75-81.7何海燕，秦燕娜，麻瓊英，林玲，藍(lán)青萍，覃擁靈.蠟

25、狀芽孢桿菌px16的篩選及產(chǎn)-葡萄糖苷酶的條件優(yōu)化j.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（02）：119-122.8kwon k，lee j， kang h g， et al.detection of -glu-cosidase activity in polyacrylamide gels with esculinas substratej. applied and environmental microbiology，1994（12）：4584-4586.9劉澤玉，蘇柘僮，楊明，鄒文栓.馬藍(lán)葉中-葡萄糖苷酶的提取及酶學(xué)性質(zhì)的研究j.中草藥，2010，41（09）：1461-1464.10姚衛(wèi)蓉，丁霄霖.pnpg法測定纖維素酶系中-葡萄糖苷酶j.微生物學(xué)通報，1998，25（03）：182-183.11秦艷，李衛(wèi)芬，黃琴.枯草芽孢桿菌