上課實(shí)驗(yàn) 固定化酶制劑教材

1、n1 1制作固定化制作固定化-淀粉酶。淀粉酶。n2 2進(jìn)行淀粉水解的測定。進(jìn)行淀粉水解的測定。 基本要求：基本要求：發(fā)展要求：發(fā)展要求：n通過此實(shí)驗(yàn)探討固定化酶的應(yīng)用價(jià)值。通過此實(shí)驗(yàn)探討固定化酶的應(yīng)用價(jià)值。 在在食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等領(lǐng)域大規(guī)食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等領(lǐng)域大規(guī)模使用酶制劑。模使用酶制劑。酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有：酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有：催化效率高、低能耗、低污染等。催化效率高、低能耗、低污染等。 1 1、通常對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑通常對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容等條件非常敏感，容易失活易失活； 2 2、溶液中的酶很、溶液中的酶很難回收難回收，不能被再次利，不能被再次利用，

2、提高了生產(chǎn)成本；用，提高了生產(chǎn)成本； 3 3、反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品、反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。質(zhì)量。( (難分離難分離）1 1、固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間、固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)（如固定在內(nèi)的技術(shù)（如固定在不溶于水的載體不溶于水的載體上）。上）。2 2、固定化酶技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：、固定化酶技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：（1 1）使酶既能與反應(yīng)物接觸，又使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物能與產(chǎn)物分離分離；酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物更易純化更易純化（2 2）固定在載體上的酶可以被）固定在載體上的酶可以被反復(fù)利用反復(fù)利用。可較長時(shí)間地貯

3、存和使用?？奢^長時(shí)間地貯存和使用。固定化酶：固定化酶：就是將水溶性的酶用物理或化學(xué)的就是將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而不溶于水而又有酶活性又有酶活性的制劑。的制劑。固定化的方法：固定化的方法：吸附法、吸附法、交聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法、包埋法、共價(jià)偶連法等共價(jià)偶連法等3.3.固定化酶方法固定化酶方法吸附法吸附法酶蛋白分子吸附在載體酶蛋白分子吸附在載體共價(jià)偶聯(lián)法共價(jià)偶聯(lián)法n酶蛋白上的一些基團(tuán)（如羧基、巰基、咪唑酶蛋白上的一些基團(tuán)（如羧基、巰基、咪唑基等）能在溫和條件下與載體共價(jià)結(jié)合，從基等）能在溫和條件下與載體共價(jià)結(jié)合，從而被固定化。

4、而被固定化。n結(jié)合部位必須不是酶的活性中心，也不是維結(jié)合部位必須不是酶的活性中心，也不是維持其空間結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)。持其空間結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)。交聯(lián)法交聯(lián)法n交聯(lián)法是指通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)交聯(lián)法是指通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法。成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法。n結(jié)合部位也不是酶的活性中心，也不是維持結(jié)合部位也不是酶的活性中心，也不是維持其空間結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)。其空間結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)。 包埋法包埋法n包埋法是將酶蛋白包埋在凝膠交聯(lián)后的包埋法是將酶蛋白包埋在凝膠交聯(lián)后的“格子格子”中中實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)是用實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)是用吸附法將吸附法將- -淀粉酶固定在石英砂淀粉酶固定在石英砂上，上，一定濃度

5、的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測試，精，用淀粉指示劑溶液測試，流出物呈紅色流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊表明水解產(chǎn)物糊精生成精生成這里使用的是這里使用的是枯草桿菌的枯草桿菌的- -淀粉酶淀粉酶，其作用的，其作用的最適溫度為最適溫度為50755075；最適；最適PHPH為為5.57.55.57.5遇碘顯藍(lán)色遇碘顯藍(lán)色遇碘顯紅色遇碘顯紅色遇碘不顯色遇碘不顯色設(shè)備及用品設(shè)備及用品: : 5ml5ml塑料注射器塑料注射器 50ml50ml燒杯燒杯 滴管滴管 自行車用氣門心及自行車用氣門心及夾子夾子 注射器架注射器架 試管

6、及微量離心管試管及微量離心管3 3支支材料材料: :1.1.- -淀粉酶的固定化淀粉酶的固定化: :在燒杯中將在燒杯中將5mg5mg- -淀粉酶溶于淀粉酶溶于4ml4ml蒸餾水中蒸餾水中. .由于酶不純由于酶不純, ,可能有些不溶物可能有些不溶物. .再加入再加入5g5g石石英砂英砂, ,不時(shí)攪拌不時(shí)攪拌,30min,30min后裝入后裝入1 1支下端接有氣門心并用夾支下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中子封住的注射器中( (石英砂體積約石英砂體積約4ml).4ml).用用1010倍體積的蒸倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游離淀粉酶除去未吸附的游離淀粉酶, ,流速為流

7、速為1ml/min1ml/min。2.2.可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液: :取取50mg50mg可溶性淀粉溶于可溶性淀粉溶于100ml100ml熱水中熱水中, ,攪拌均勻。攪拌均勻。3. 5mmol/L KI-I3. 5mmol/L KI-I2 2溶液：溶液：稱取稱取0.127g0.127g碘和碘和0.83g0.83g碘化鉀。碘化鉀。加蒸餾水加蒸餾水100ml100ml完全溶解后裝入滴瓶中。完全溶解后裝入滴瓶中。固定化裝置固定化裝置反應(yīng)柱反應(yīng)柱固定化酶固定化酶氣門心氣門心夾子夾子5ml5ml注射器注射器步驟步驟: :1.1.將灌注了固定化將灌注了固定化酶的注射器放在注酶的注射器放在注射器架上射

8、器架上, ,用滴管滴用滴管滴加淀粉溶液加淀粉溶液, ,使淀粉使淀粉溶液以溶液以0.3ml/min0.3ml/min的的流速過柱流速過柱. .在流出在流出5ml5ml后接收后接收0.5ml0.5ml流流出液出液, ,加入加入1212滴滴KI-KI-I I2 2溶液溶液, ,觀察顏色。觀察顏色。用水稀釋用水稀釋1 1倍后再觀倍后再觀察顏色。察顏色。反應(yīng)柱反應(yīng)柱固定化酶固定化酶氣門心氣門心夾子夾子5ml5ml注射器注射器淀粉淀粉實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果 1 2 3 41、2mL水+ +12滴KI-I2溶液2、2mL淀粉液+ +12滴KI-I2溶液3、2mL淀粉濾液+ +12滴KI-I2溶液4、2mL淀粉濾液

9、+ +12滴KI-I2溶液+ +稀釋1倍2.2.實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)后, ,用用1010倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱, ,放置放置在在44冰箱中冰箱中, ,幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn), ,看是否有相看是否有相同的結(jié)果同的結(jié)果. .實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)na.控制滴灌流速控制滴灌流速。0.3mL/min的流速，我們就的流速，我們就可以控制每分鐘滴管流出量為每分鐘可以控制每分鐘滴管流出量為每分鐘6滴（滴（6=0.3mL/ 50uL）。這樣做的目的是控制流速）。這樣做的目的是控制流速讓淀粉和淀粉酶充分接觸，反應(yīng)。讓淀粉和淀粉酶充分接觸，反應(yīng)。b.顯色顯色。在流出。在流出5mL后接取后接取0.5mL過濾液，然后向試過濾液，然后向試管中加入管中加入1-2滴滴KI-I2 溶液。切記，溶液。切記，KI-I2 溶液不要加入溶液不要加入太多，以免碘液顏色覆蓋糊精淀粉反應(yīng)后的顏色。太多，以免碘液顏色覆蓋糊精淀粉反應(yīng)后的顏色。課后練習(xí)課后練習(xí) 1.如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒有淀粉酶如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒有淀粉酶?2.耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途?可在試管中加入可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。