歸一化法內(nèi)標法外標法

1、歸一化法normalization method 一種常用的色譜定量方法。 歸一化法是把樣品中 各個組分的峰面積乘以各自的相對校正因子并求和， 此和值相當丁所有組分的總 質(zhì)量，即所謂“歸一”，樣品中某組分i的白分含量可用下式計算：pt%= Aifi/(A1f1+A2f2 + .Anfn )*100式中f1、f2、fn,為各組分的相對校正因子，A1、A2、，An為各組分的峰面 積。如果操作條件穩(wěn)定，也可以用峰高歸一化法定量，此時組分 i的白分含量可按下式計算：pt%= hifi/(h1f1+h2f2 + .hnfn )*100式中f1、f2、fn、，為各組分在該操作條件下特定的峰高相對校正因子，

2、h1、h2、，hn為各組分的峰高。用歸一化法定量時，必須保證樣品中所有組分都能流出色 譜柱，并在色譜圖上顯示色譜峰。, 定量方法 色譜中常用的定量方法有:當試樣中各組分都能流出色譜柱且在檢測器上均有響應, 已知時，a.校正歸一化法各組分的相對校正因子可用此法定量。組分i在混合物中的白分含量可由下式計算：x 100 %可為質(zhì)量校正因子，也可為摩爾校正因子。其中fi若各組分的定量校正因子相近或相同(如同系物中沸點接近的組分)，則上式可簡化為：-,: |該法簡稱為歸一化法。校正歸一化法的優(yōu)點是：簡便、準確，當操作條件如進樣量、流速變化時，對定 量結果影響很小。缺點是：對該法的苛刻要求限制了該法的使用

3、。 該法適合丁常 量物質(zhì)的定量。b.內(nèi)標法所謂內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標物， 加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被 測物和內(nèi)標物的質(zhì)量及在色譜圖上相應的峰面積比，求出某組分的白分含量。當只需測定試樣中某幾各組分時， 而且試樣中所有組分不能全部出峰時， 可用此 法。此法適合丁微量物質(zhì)的分析。該法的計算公式如下：% =叭無，加曰叩%m - A5其中，fsi是被測組分相對丁內(nèi)標物的相對校正因子。該法的優(yōu)點是：受操作條件的影響較小，定量結果較為準確，使用上不象歸一化 法那樣受到限制。該法的缺點是：每次分析必須準確稱量被測物和內(nèi)標物， 不適 合丁快速分析。內(nèi)標物的選擇十分重要。它應該是試樣中不存在的物質(zhì)

4、；加入的量應接近丁被測 組分色譜；同時要求內(nèi)標物的色譜峰位丁被測組分色譜附近或幾個被測組分色譜 峰的中間，并與這些組分完全分離；內(nèi)標物必須不與樣品發(fā)生反應等。c.外標法（定量進樣-標準曲線法）所謂外標法就是應用被測組分的純物質(zhì)來繪制濃度 c對響應值A （h）的標準曲 線，然后測試被測樣品中被測組分的響應信號 （峰面積或峰高），由標準曲線即 可查出或通過線型回歸計算出其白分含量。該法必須定量進樣，即測定標準曲線和測定未知物時， 進入色譜中的樣品量必須 一致。該法的優(yōu)點是：操作簡單，計算方便，缺點是：結果的準確度取決丁進樣量的重 現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時（如工

5、廠的中間控制分析）可不必繪 制標準曲線，而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量十分接近的濃度為 Cs的標準溶液，定量進樣，由下式計算被測物的含量。關丁歸一化法的一些問題？歸一化法中的校正因子如何得到？ ？ ？如果不做，采用面積歸一化法的誤差大嗎？一般那么多的校正因子不可能一一測出呀？可以估算嗎？歸一化法中的校正因子是通過配制與樣品相同組分的標準品求出的。如果不做相對校正因子，采用面積歸一化法的誤差大小取決與被測各組分在 檢測器上的單位質(zhì)量的應答值大小，比如FID檢測器測苯和甲烷不用相對校正因 子，測定結果會相差喲5倍，2-甲基戊烷和3-甲基戊烷測定結果會相同。個別的小峰不能定性的用臨近的峰校

6、正因子代替。內(nèi)標法internal standard method 是色譜分析中一種比較準確的定量方法， 尤其 在沒有標準物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標法是將一定重量的純物質(zhì)作為 內(nèi)標物（參見內(nèi)標物條）加到一定量的被分析樣品混合物中， 然后對含有內(nèi)標物 的樣品進行色譜分析，分別測定內(nèi)標物和被測組分的峰面積 （或峰高）及相對校 正因子，按下列公式即可求出被測組分在樣品中的白分含量：Ai fi WsWi %=100%As fs W式中Wi %為被測組分的白分含量；Ai , As分別為組分和內(nèi)標物的峰面積；fi, fs分別為組分和內(nèi)標物的相對校正因子； Ws為內(nèi)標物的重量；W為樣品的重量。內(nèi)標法

7、是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物， 加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣 和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。選擇內(nèi)標物有4個要求：1.內(nèi)標物應是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全 溶丁試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的量應接近 丁被測組分；4.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近， 或在幾個被測 組分色譜峰中間。內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結果較為準確，由丁通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積 的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤 差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量， 有時尋找

8、合適的內(nèi)標物也有困難。內(nèi)標法什么叫內(nèi)標法？怎樣選擇內(nèi)標物？內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時, 加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出丁操作條件的波動而對分析結果產(chǎn)生的影響，以提高分析結果的準確度。內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術。使用內(nèi)標法時，在樣 品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，乂不受試樣中其它組分峰的 干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應值，即可求出待測組分在樣品中的白分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。 理想地說，內(nèi)標物應當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知 的量加到樣品中去，它應當和被分析

9、的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理 化學性質(zhì)（如化學結構、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 ）、色譜行為和響應 特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。 當然，在色譜分析條彳十下，內(nèi)標物必須 能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較 關心化臺物在一個復雜過程中所得到的回收率， 此時，他可以使用一種在這種過 程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標， 來測定感興趣化合物的白分回收率， 而 不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面 積的比值？影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜 方面的和儀器方面的三

10、類。由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復樣品時出現(xiàn)?；瘜W方面的因素包括：1、內(nèi)標物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應，3、內(nèi)標物純度可變等。對丁一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些， 色譜上常見的一些問題（如滲漏）對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要 小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃 度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應足夠小并保持不變，這樣才不 致丁造成檢測器和積分裝置飽和。 如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正 常的

11、話，應著重檢查積分裝置和設置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的 最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對包定，在制作內(nèi)標標準曲線時應注意什么？在用內(nèi)標法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣 品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關系曲線， 此曲線即 為標準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應盡可能與制作標準曲線時所 用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件（如固定相、柱溫、載氣流速等）,還應注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時， 各點并不完全落在直線上，此時應求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準 偏差，在使用過程中應定期進

12、行單點校正，若所得值與平均值的偏差小丁2,曲線仍可使用，若大丁 2,則應重作曲線，如果曲線在皎短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，貝U 不宜使用內(nèi)標法定量。外標法用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應信 號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。 工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜 率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液， 根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線 法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等丁零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點

13、法（直接比較法）定量。外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中 i組分 的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣， 測得峰面積的平均值， 用下式計算樣品中i組分的量：W = A（W） / （A）式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及 相應的峰面積。（W）及（A）分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面 積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰， 均可對 待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外， 為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組 分的濃度相近。夕卜標

14、法 external standard method色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物質(zhì)加入到被測樣品中，而 是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定， 把得到的色譜峰面積與被測組分的 色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。 外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要 求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應與被測物濃度相接近，以利丁定量分析的準確性。三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法（來源：藥物分析網(wǎng)）選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有 的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。 再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定

15、量參數(shù)。 用內(nèi)標法公式計算即可。內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物， 加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被 測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。選擇內(nèi)標物有4個要求：1.內(nèi)標物應是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它 必須完全溶丁試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的 量應接近丁被測組分；4.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近， 或在 幾個被測組分色譜峰中間。內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結果較為準確，由丁通過測量內(nèi)標物及被測組分 的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所 引起的誤差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析

16、時內(nèi)標物和試樣都要 準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操 作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至丁哪一種方法好與不好不能一 概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題， 我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中問體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差， 結果經(jīng)常受 到搞合成同事的質(zhì)疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分 析，首先我們的實驗室儀器和

17、手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如， 襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化 溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附 近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等 等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對丁精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結果RSD都 能滿足小丁 1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的 影響因素是一定要都考慮到的，否則談論這個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥

18、公司提供的比較完善 而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足 RSD小丁 1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標， 都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、 樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屆設備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時 外標的結果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動 進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響， 這時內(nèi)標可 能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、 上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情 況，小丁 1%和大丁 1%小丁 1.5%。如果RSD的結果小丁 1%,那這個方法就 沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結果大丁 1%而在1.5%略低一些的范圍活 動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附 近，就要嘗試內(nèi)標了，如