歸一化法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法

1、歸一化法normalization method 一種常用的色譜定量方法。 歸一化法是把樣品中 各個(gè)組分的峰面積乘以各自的相對(duì)校正因子并求和， 此和值相當(dāng)丁所有組分的總 質(zhì)量，即所謂“歸一”，樣品中某組分i的白分含量可用下式計(jì)算：pt%= Aifi/(A1f1+A2f2 + .Anfn )*100式中f1、f2、fn,為各組分的相對(duì)校正因子，A1、A2、，An為各組分的峰面 積。如果操作條件穩(wěn)定，也可以用峰高歸一化法定量，此時(shí)組分 i的白分含量可按下式計(jì)算：pt%= hifi/(h1f1+h2f2 + .hnfn )*100式中f1、f2、fn、，為各組分在該操作條件下特定的峰高相對(duì)校正因子，

2、h1、h2、，hn為各組分的峰高。用歸一化法定量時(shí)，必須保證樣品中所有組分都能流出色 譜柱，并在色譜圖上顯示色譜峰。, 定量方法 色譜中常用的定量方法有:當(dāng)試樣中各組分都能流出色譜柱且在檢測(cè)器上均有響應(yīng), 已知時(shí)，a.校正歸一化法各組分的相對(duì)校正因子可用此法定量。組分i在混合物中的白分含量可由下式計(jì)算：x 100 %可為質(zhì)量校正因子，也可為摩爾校正因子。其中fi若各組分的定量校正因子相近或相同(如同系物中沸點(diǎn)接近的組分)，則上式可簡(jiǎn)化為：-,: |該法簡(jiǎn)稱為歸一化法。校正歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量、流速變化時(shí)，對(duì)定 量結(jié)果影響很小。缺點(diǎn)是：對(duì)該法的苛刻要求限制了該法的使用

3、。 該法適合丁常 量物質(zhì)的定量。b.內(nèi)標(biāo)法所謂內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物， 加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被 測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及在色譜圖上相應(yīng)的峰面積比，求出某組分的白分含量。當(dāng)只需測(cè)定試樣中某幾各組分時(shí)， 而且試樣中所有組分不能全部出峰時(shí)， 可用此 法。此法適合丁微量物質(zhì)的分析。該法的計(jì)算公式如下：% =叭無(wú)，加曰叩%m - A5其中，fsi是被測(cè)組分相對(duì)丁內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)校正因子。該法的優(yōu)點(diǎn)是：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較為準(zhǔn)確，使用上不象歸一化 法那樣受到限制。該法的缺點(diǎn)是：每次分析必須準(zhǔn)確稱量被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物， 不適 合丁快速分析。內(nèi)標(biāo)物的選擇十分重要。它應(yīng)該是試樣中不存在的物質(zhì)

4、；加入的量應(yīng)接近丁被測(cè) 組分色譜；同時(shí)要求內(nèi)標(biāo)物的色譜峰位丁被測(cè)組分色譜附近或幾個(gè)被測(cè)組分色譜 峰的中間，并與這些組分完全分離；內(nèi)標(biāo)物必須不與樣品發(fā)生反應(yīng)等。c.外標(biāo)法（定量進(jìn)樣-標(biāo)準(zhǔn)曲線法）所謂外標(biāo)法就是應(yīng)用被測(cè)組分的純物質(zhì)來(lái)繪制濃度 c對(duì)響應(yīng)值A(chǔ) （h）的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，然后測(cè)試被測(cè)樣品中被測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào) （峰面積或峰高），由標(biāo)準(zhǔn)曲線即 可查出或通過(guò)線型回歸計(jì)算出其白分含量。該法必須定量進(jìn)樣，即測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定未知物時(shí)， 進(jìn)入色譜中的樣品量必須 一致。該法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，計(jì)算方便，缺點(diǎn)是：結(jié)果的準(zhǔn)確度取決丁進(jìn)樣量的重 現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。當(dāng)被測(cè)試樣中各組分的濃度變化范圍不大時(shí)（如工

5、廠的中間控制分析）可不必繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而用單點(diǎn)校正法。即配制一個(gè)與被測(cè)組分含量十分接近的濃度為 Cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，由下式計(jì)算被測(cè)物的含量。關(guān)丁歸一化法的一些問(wèn)題？歸一化法中的校正因子如何得到？ ？ ？如果不做，采用面積歸一化法的誤差大嗎？一般那么多的校正因子不可能一一測(cè)出呀？可以估算嗎？歸一化法中的校正因子是通過(guò)配制與樣品相同組分的標(biāo)準(zhǔn)品求出的。如果不做相對(duì)校正因子，采用面積歸一化法的誤差大小取決與被測(cè)各組分在 檢測(cè)器上的單位質(zhì)量的應(yīng)答值大小，比如FID檢測(cè)器測(cè)苯和甲烷不用相對(duì)校正因 子，測(cè)定結(jié)果會(huì)相差喲5倍，2-甲基戊烷和3-甲基戊烷測(cè)定結(jié)果會(huì)相同。個(gè)別的小峰不能定性的用臨近的峰校

6、正因子代替。內(nèi)標(biāo)法internal standard method 是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法， 尤其 在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照時(shí)，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為 內(nèi)標(biāo)物（參見(jiàn)內(nèi)標(biāo)物條）加到一定量的被分析樣品混合物中， 然后對(duì)含有內(nèi)標(biāo)物 的樣品進(jìn)行色譜分析，分別測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和被測(cè)組分的峰面積 （或峰高）及相對(duì)校 正因子，按下列公式即可求出被測(cè)組分在樣品中的白分含量：Ai fi WsWi %=100%As fs W式中Wi %為被測(cè)組分的白分含量；Ai , As分別為組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積；fi, fs分別為組分和內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)校正因子； Ws為內(nèi)標(biāo)物的重量；W為樣品的重量。內(nèi)標(biāo)法

7、是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物， 加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣 和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全 溶丁試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近 丁被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近， 或在幾個(gè)被測(cè) 組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由丁通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積 的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤 差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量， 有時(shí)尋找

8、合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。內(nèi)標(biāo)法什么叫內(nèi)標(biāo)法？怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物？?jī)?nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí), 加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出丁操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，在樣 品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，乂不受試樣中其它組分峰的 干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的白分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。 理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知 的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析

9、的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理 化學(xué)性質(zhì)（如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 ）、色譜行為和響應(yīng) 特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。 當(dāng)然，在色譜分析條彳十下，內(nèi)標(biāo)物必須 能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較 關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中所得到的回收率， 此時(shí)，他可以使用一種在這種過(guò) 程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)， 來(lái)測(cè)定感興趣化合物的白分回收率， 而 不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面 積的比值？影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜 方面的和儀器方面的三

10、類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)?；瘜W(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對(duì)丁一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些， 色譜上常見(jiàn)的一些問(wèn)題（如滲漏）對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要 小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃 度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不 致丁造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。 如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正 常的

11、話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的 最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)包定，在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么？在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣 品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線， 此曲線即 為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所 用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件（如固定相、柱溫、載氣流速等）,還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)， 各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn) 偏差，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)

12、行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小丁2,曲線仍可使用，若大丁 2,則應(yīng)重作曲線，如果曲線在皎短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，貝U 不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。外標(biāo)法用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信 號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。 工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜 率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液， 根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線 法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等丁零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)

13、法（直接比較法）定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中 i組分 的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣， 測(cè)得峰面積的平均值， 用下式計(jì)算樣品中i組分的量：W = A（W） / （A）式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及 相應(yīng)的峰面積。（W）及（A）分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面 積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰， 均可對(duì) 待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外， 為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組 分的濃度相近。夕卜標(biāo)

14、法 external standard method色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而 是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定， 把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的 色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。 外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要 求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利丁定量分析的準(zhǔn)確性。三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法（來(lái)源：藥物分析網(wǎng)）選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒(méi)有 的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。 再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定

15、量參數(shù)。 用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物， 加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被 測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它 必須完全溶丁試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的 量應(yīng)接近丁被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近， 或在 幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由丁通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分 的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所 引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析

16、時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要 準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操 作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至丁哪一種方法好與不好不能一 概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題， 我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的。1、以前做過(guò)很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中問(wèn)體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒(méi)有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差， 結(jié)果經(jīng)常受 到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分 析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和

17、手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如， 襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化 溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附 近有沒(méi)有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等 等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)丁精密度的要求，同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都 能滿足小丁 1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的 影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過(guò)的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥

18、公司提供的比較完善 而驗(yàn)證過(guò)的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足 RSD小丁 1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)， 都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問(wèn)題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、 樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屆設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí) 外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng) 進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響， 這時(shí)內(nèi)標(biāo)可 能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。2、 上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿足1.5%的要求時(shí)，也分為兩種情 況，小丁 1%和大丁 1%小丁 1.5%。如果RSD的結(jié)果小丁 1%,那這個(gè)方法就 沒(méi)有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大丁 1%而在1.5%略低一些的范圍活 動(dòng)時(shí)，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附 近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如