蝴蝶蘭生產(chǎn)技術規(guī)程

1、河南省質(zhì)量技術監(jiān)督局 發(fā)布2009-12-30 實施2009-12-01發(fā)布蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術規(guī)程DB41/T 6022009DB41河南省地方標準8 / 10文檔可自由編輯打印前 言為規(guī)范河南省境內(nèi)蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)技術，結合我省生產(chǎn)實際和地域特點，制訂本地方標準。本標準附錄A、B為規(guī)范性附錄，附錄C為資料性附錄。本標準由河南省濟源市農(nóng)業(yè)科學研究所提出并起草。本標準主要起草人：王梅、鐘士傳、李銘、陳麗、牛小沛、劉星明、陳火星。本標準于2009年12月01日發(fā)布。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術規(guī)程1 范圍本標準規(guī)定了蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)技術相關定義、設施設備、組培技術、煉苗移栽等內(nèi)容。本標準適用于河南省境內(nèi)的蝴

2、蝶蘭組織培養(yǎng)。2 定義下列定義適用于本標準。2.1 植物組織培養(yǎng)從植物體分離出符合需要的器官、組織或細胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術。2.2 外植體由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的器官、組織或細胞、原生質(zhì)體。2.3 培養(yǎng)基供植物外植體存活和生長所必需的介質(zhì)，通常由水、無機鹽、有機物質(zhì)、凝固劑、糖以及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成。2.4 初代培養(yǎng)接種外植體后繼代培養(yǎng)之前的培養(yǎng)。2.5 繼代培養(yǎng)對來自于初代培養(yǎng)獲得的芽、原球莖等，通過分離切割并更新培養(yǎng)基，使培養(yǎng)材料數(shù)量上增加，并得到無根的幼苗。2.6 生根培養(yǎng)把無根的幼苗轉接

3、到生根培養(yǎng)基中誘導生根，培養(yǎng)成生根苗的過程。2.7 煉苗在保護設施中，采取逐步通風、控溫、遮光等措施，使幼苗適應外界環(huán)境的過程。2.8 變異 在組織培養(yǎng)過程中受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等影響，從外部形態(tài)上表現(xiàn)出有別于原品種的現(xiàn)象。3 設施設備3.1 組培設施與設備3.1.1 組培設施一般由洗滌室、滅菌室、培養(yǎng)基配制室、無菌接種室、培養(yǎng)室、煉苗室組成。 3.1.2 儀器設備3.1.2.1洗滌室主要有自動或半自動洗瓶機、水槽、塑料箱、干燥箱、晾瓶架等。3.1.2.2滅菌室主要有高壓蒸汽滅菌鍋、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微孔濾器等。3.1.2.3培養(yǎng)基配制室主要有電子天平(0.0001g、0.01g)、量

4、筒、微波爐、冰箱、移液管、燒杯、酸度計、容量瓶、藥品柜、實驗臺等。 3.1.2.4無菌接種室主要有超凈工作臺、或酒精燈、剪刀、鑷子等 。3.1.2.5培養(yǎng)室主要有培養(yǎng)架、紫外燈及控溫、控濕、控時設備等。 3.2 煉苗移栽設施3.2.1 溫室要求冬季能加溫，夏季能降溫，能控制光照、溫度、濕度等的日光溫室、玻璃溫室或PC板溫室等。3.2.2溫室設施主要有栽培床、灌溉設備、穴盤等。4 組培技術4.1 母株選擇應選擇觀賞性狀好、生長健壯、無病蟲害、花期長的優(yōu)良品種。4.2 培養(yǎng)基配制及滅菌4.2.1 培養(yǎng)基的選擇常用MS和花寶培養(yǎng)基。4.2.2 母液配制 MS培養(yǎng)基一般由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機

5、物、調(diào)節(jié)物質(zhì)等五大類。成分及用量見附錄A?；▽毰囵B(yǎng)基不用配制母液，直接使用。4.2.3 培養(yǎng)基的配制4.2.3.1 配料按培養(yǎng)基的配方及所需培養(yǎng)基的數(shù)量，分別吸取所需的母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，加入稱量好的蔗糖、瓊脂以及其它需要的物質(zhì)，如活性炭等，混合后倒入煮培養(yǎng)基的鍋中，并加入少量的蒸餾水。 4.2.3.2 裝瓶加熱培養(yǎng)基至瓊脂完全溶化，用蒸餾水將培養(yǎng)基定容至所需體積，并用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH。趁熱把煮好的培養(yǎng)基分裝入培養(yǎng)瓶，蓋上培養(yǎng)瓶蓋。分裝時應不斷攪拌，并不要把培養(yǎng)基沾附在瓶口。4.2.3.3 滅菌將分裝好的培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內(nèi)，采用濕熱空氣滅菌法（滅

6、菌壓力0.11 MPa0.14MPa、溫度120126、時間15min20min）進行滅菌。無菌水、接種工具（手術刀、鑷子、墊紙等）也均采用此法滅菌。培養(yǎng)基高壓滅菌取出后，置于室溫至培養(yǎng)基凝固后即可使用。4.3 外植體選擇與處理4.3.1花梗側芽選擇與處理選取已開有少數(shù)花的健壯花序，切取帶有芽的花梗節(jié)段，將其進行沖洗，用10%的漂白粉溶液表面滅菌20min，除去腋芽的苞葉，再在5%的漂白粉溶液中表面滅菌3min，無菌水沖4次5次。4.3.2 種胚培養(yǎng)選擇與處理4.3.2.1種胚來源4.3.2.1.1 授粉條件人工授粉時,首先要選好親本,雌花最好的授粉時間是開花3d4d。4.3.2.1.2 授粉

7、過程授粉時先將母本的花粉塊除去,再將父本的花粉塊用小鑷子鑷起,輕輕地放在母本的蕊腔上,因蕊腔中有粘液將花粉塊粘附,不必擔心花粉塊脫落。4.3.2.1.3 果實采收 雜交后120d左右，當果實呈黃綠色時及時采收。4.3.3 無菌處理果實采收后，用流動水沖洗干凈，移到超凈工作臺上，用75%酒精浸泡8min10 min，再用10%漂白粉溶液中浸10min，然后用無菌水沖洗4次5次。4.4 接種4.4.1 花梗側芽接種在無菌紙上，用小刀切取0.5cm1cm的莖段，轉接到配好的誘導培養(yǎng)基。4.4.2 無菌播種將果實放在無菌紙上，用手術刀剖開果實取出粉狀種胚，將消毒后的種胚均勻地播種到無菌播種培養(yǎng)基上。4

8、.5 繼代培養(yǎng)接種后1個月2個月培養(yǎng)物即可形成芽或原球莖，轉接到芽繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA3 mg/L +NAA0.2 mg/L +活性炭1.5g/L+2%蔗糖+0.7%瓊脂,PH5.8或原球莖培養(yǎng)基上：花寶1號0.5g/L、蛋白胨2.0 g/L、肌醇0.1 g/L、磷酸三鈣0.1 g/L、香蕉100.0 g/L、蔗糖20.0 g/L、瓊脂7.0 g/L，PH5.8。以后即發(fā)芽生根長葉。如要進一步擴繁，應在其發(fā)芽前把它切成小塊進行轉移，讓它繼續(xù)不斷地形成原球莖球狀體。 4.6 生根培養(yǎng)把無根幼苗轉接到生根培養(yǎng)基1/2MS+BA1mg/L+NAA0.55mg/L+2%蔗糖+0.7%瓊脂，pH5

9、.4。4.7 培養(yǎng)條件光照強度2000Lx，光照時間每天13h，保持恒溫25±2。4.8 改進措施參照附錄C。5 煉苗移栽5.1 溫室消毒移栽前半個月，用1%的甲醛溶液對溫室進行熏蒸消毒；用石灰水或高錳酸鉀溶液對地面消毒；用高錳酸鉀溶液對工具浸泡消毒。5.2 煉苗長出23片葉子的生根苗即可進行煉苗。先將生根苗連同容器一起置于移栽設施中，放置1周，然后打開瓶口再放置2d3d。5.3 移栽5.1 移栽時要求移栽前先將水草用1000倍的多菌靈或百菌清浸泡24h，使其充分吸收水分，然后用脫水機將其脫水至手握無水下滴即可用于移栽。移栽時小心取出生根苗,用清水洗去根部粘附的培養(yǎng)基,用水草包住幼苗

10、根部移栽到穴盤中。5.4 環(huán)境要求5.4.1 空氣濕度保持在80%90%，遮光率50%,光照強度 10000Lx左右,環(huán)境溫度控制在2226。5.4.2 經(jīng)1個月2 個月的管理,待小苗長出12對新葉時移栽到營養(yǎng)缽中。隨著幼苗的生長,逐漸更換大的營養(yǎng)缽。5.4.3 在小苗管理期間要經(jīng)常噴水,但水苔不能積水或過濕 ,防止爛根。每隔 2周3 周追1次稀薄液體肥料 ,定期噴灑殺菌劑 ,預防病害發(fā)生。附錄A（規(guī)范性附錄）MS基本培養(yǎng)基配制用量表種類成分配1L母液稱取量(mg)使用濃度(mg/L)配1L培養(yǎng)基吸取母液量（ml）大量元素硝酸鉀KNO3190001900100硝酸銨NH4NO316500165

11、0磷酸二氫鉀KH2PO41700170硫酸鎂MgSO4.7H2O3700370氯化鈣CaCl2.2H2O4400440微量元素碘化鉀KI830.8310硼酸H3BO36206.2硫酸錳MnSO4.4H2O223022.3硫酸鋅ZnSO4.7 H2O8608.6鉬酸鈉Na2MoO4.2 H2O250.25硫酸銅CuSO4.5 H2O2.50.025氯化鈷CoCl22.50.025鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA.2 H2O373037.310硫酸亞鐵FeSO4.7H2O278027.8有機物肌醇1000010010甘氨酸2002鹽酸硫胺素/VB1400.4鹽酸吡哆醇/VB6500.5煙酸VB

12、5或VPP500.5調(diào)節(jié)物質(zhì)BA50依據(jù)各培養(yǎng)階段取量NAA50蔗糖2000020000瓊脂70007000pH5.8附錄B（規(guī)范性附錄）蝴蝶蘭組織培養(yǎng)工藝流程無根芽苗初培養(yǎng)優(yōu)良單株材料外植體制作材料調(diào)整消毒外植體接種培養(yǎng)基制作pH調(diào)整高壓蒸汽滅菌常溫冷卻凝固培養(yǎng)基分裝容器械洗滌干燥煉 苗 移 栽生根苗繼代培養(yǎng)過渡適應培養(yǎng)穴盤密集移栽速生培育容器苗容器移栽營養(yǎng)缽育苗基質(zhì)配制水草清洗商品苗定植苗圃電導率測定消毒pH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)光照調(diào)節(jié)濕度生長劑調(diào)節(jié)溫度根外追肥病蟲防治施肥環(huán)境消毒光照調(diào)節(jié)溫度調(diào)節(jié)濕度調(diào)節(jié)附錄C（資料性附錄）培養(yǎng)容器中培養(yǎng)物的表現(xiàn)、可能原因及改進措施表 表C1培養(yǎng)階段培養(yǎng)物的表現(xiàn)癥狀產(chǎn)

13、生的可能原因可供選擇的改進措施初代培養(yǎng)水浸狀變色、壞死莖斷面附近干枯表面滅菌劑過大；時間過長；外植體選用部位不當；時期不當試用較溫和的殺菌劑，降低濃度、減少時間。試用其他部位，改在生長初、中期采樣。長時間沒有反應生長素種類不當；用量不足；溫度不適宜增加生長素，增加2，4-D。調(diào)整培養(yǎng)室溫度愈傷組織旺盛，疏松，后期水狀生長素、細胞分裂素用量過大；培養(yǎng)溫度過高；培養(yǎng)基滲透勢低減少生長素、細胞分裂素用量，適當降低溫度。愈傷組織生長緊密、平滑或突起粗厚、生長緩慢細胞分裂素用量大；糖濃度過高；生長素過量亦可引起減少細胞分裂素和糖的用量側芽不萌發(fā)、皮層過膨大，皮孔長出愈傷組織選材樣本過嫩，生長素、細胞分裂

14、素用量過大減少生長素、細胞分裂素用量繼代培養(yǎng)階段再分化與叢芽苗增殖苗分化量少，速度慢，分枝少，個別長的高細胞分裂素不足；溫度偏高；光照不足增加細胞分裂素，降低溫度，苗分化數(shù)量較多，生長慢，部分畸形，節(jié)間短，苗叢密集，過度微型化細胞分裂素用量過多；溫度不適宜減少生長素或停用一段時間，調(diào)節(jié)適當溫度苗分化數(shù)量較少，苗畸形，培養(yǎng)較久苗可能在愈傷組織分化生長素用量偏高；溫度偏高減少生長素用量，適當降低溫度葉粗厚變脆生長素用量過高；或兼用細胞分裂素用量偏高適當減少生長素用量，避免葉接觸培養(yǎng)基再生苗的葉緣、葉面等處，偶有不定芽細胞分裂素用量過高；亦或該種植物適宜于這種再升式減少細胞分裂素用量，或分階段利用這

15、一再生方式叢生苗過于細弱，不適于生根操作和移栽細胞分裂素過多；溫度過高；光照不足；長時間不轉接；空間小減少細胞分裂素用量，延長光照時間，增加光照，及時轉接，降低溫度培養(yǎng)階段培養(yǎng)物的表現(xiàn)癥狀產(chǎn)生的可能原因可供選擇的改進措施常有黃葉、死苗夾于叢生苗中，部分苗逐漸衰弱，生長停止瓶內(nèi)氣體狀況惡化，pH變化過大；時間長不轉接；糖以消耗；光合作用不足自身維持；瓶內(nèi)乙烯含量高；培養(yǎng)物已污染；溫度不適部分措施同上。去除污染，控制溫度幼苗生長無力陸續(xù)發(fā)黃落葉，組織水浸狀、熟狀部分原因同上。植物激素配比不適，無機鹽濃度不當部分措施同上。及時轉接，適當調(diào)節(jié)激素配比幼苗淡綠，部分失綠鐵鹽不足，PH值不適，鐵、錳、鎂元素配失調(diào)，光過強，溫度不適仔細配制培養(yǎng)基，注