發(fā)光分析1和2

1、郭良洽郭良洽食品安全分析與檢測(cè)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品安全分析與檢測(cè)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室( (福州大學(xué)福州大學(xué)) )福州大學(xué)碩士研究生課程發(fā)光分析發(fā)光分析教學(xué)參考書(shū)：教學(xué)參考書(shū)：n熒光分析法（第二版或第三版）；陳國(guó)珍主編；科學(xué)出版社；1990n化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光理論與應(yīng)用；陳國(guó)南，張帆著；福建科學(xué)技術(shù)出版社；1997n化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)理論與應(yīng)用；林金明編著；化學(xué)工業(yè)出版社；2004nElectrogenerated Chemiluminescence；Allen J Bard；Marcel Dekker，Inc；2004nACS(/)，Elsevier(http

2、:/ 引言引言L(fǎng)uminescence is the emission of light by a substance. It occurs when an electron returns to the electronic ground state from an excited state and loses its excess energy as a photon. 1cm excitation mode luminescence type thermally activated ion recombination thermoluminescence high energy par

3、ticles or radiation radioluminescence friction triboluminescence sound waves sonoluminescence absorption of radiation (UV/VIS) photoluminescence chemical reaction chemiluminescence, bioluminescenceinjection of charge electroluminescence 2.2.發(fā)光類(lèi)型發(fā)光類(lèi)型Thermoluminescence熱致發(fā)光熱致發(fā)光nThermoluminescence is a

4、form of luminescence when absorbed light is re-emitted on heating.nSome mineral substances such as fluorite store energy when exposed to ultraviolet or other ionising radiation. This energy is released in the form of light when the mineral is heated; the phenomenon is distinct from that of black bod

5、y radiation.Radioluminescence放射發(fā)光放射發(fā)光n是指因受高能粒子或輻照的激發(fā)而發(fā)光的現(xiàn)象。一些老式的鐘表晚上可以發(fā)光可見(jiàn)表針，就是在其表面涂了一層放射發(fā)光的材料。radioluminescence：Luminescence arising from excitation by high-energy particles or radiationTriboluminescence摩擦發(fā)光摩擦發(fā)光triboluminescence：Luminescence resulting from the rubbing together of the surface of cer

6、tain solids. It can be produced, for example, when solids are crushed. Sonoluminescence聲致發(fā)光sonoluminescence：the weak emission of light flashes by bubbles in a liquid excited by sound (a pressure wave). Sonoluminescence arises from cavitation, i.e. the formation, growth and collapse of microbubbles,

7、which produces excited state species.nFigure 1. Possible luminescent fates for an atom or molecule after electronic excitation.emission of lightIncandescencephosphorescencebioluminescencechemiluminescenceluminescencefluorescenceimmediately?YesYesYesYesYesNoNoNoNoNoTriboluminescencewith heating?from

8、mechanical forces?inanimate?with excitation by light?n本課程主要涉及:nPhotoluminescence（Fluorescence & Phosphorescence）n光致發(fā)光（熒光和磷光）nChemiluminescence & Biochemiluminescencen化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光nElectrogenerated chemiluminescence (electroluminescence)n電致化學(xué)發(fā)光第二章第二章 熒光熒光n2.1 熒光發(fā)展歷程Each electron has unique set of

9、 quantum numbers (Pauli Exclusion Principle)nn principal (1s, 3p. ) 主量子數(shù)nl angular momentum (l=0=s, l=1=p. ) 角量子數(shù)nm magnetic 磁量子數(shù)ns spin 自旋量子數(shù)2.2.1 Electronic States電子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)電子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)n2.2 熒光產(chǎn)生原理nAny two electrons in same orbital (n, l, m) must have different spinsns = + or - nS = si （對(duì)于多個(gè)電子，總自旋量子數(shù)是價(jià)電子自旋量子

10、數(shù)的矢量和）譜線(xiàn)多重性譜線(xiàn)多重性M M：總角量子數(shù)：總角量子數(shù)L L與總自旋量子數(shù)與總自旋量子數(shù)S S之間的電磁相互作之間的電磁相互作用產(chǎn)生光譜多重線(xiàn)用產(chǎn)生光譜多重線(xiàn)M: 2S+1 (either 1, 2, 3. ) 式中式中S S為電子的總自旋量子數(shù)，為電子的總自旋量子數(shù)，M M則表示分子中電子的則表示分子中電子的總自旋角動(dòng)量在總自旋角動(dòng)量在Z Z軸方向的可能值。軸方向的可能值。M=1為為單重態(tài)單重態(tài)或單線(xiàn)態(tài)；或單線(xiàn)態(tài)； M=3為為三重態(tài)三重態(tài)或三線(xiàn)態(tài)?；蛉€(xiàn)態(tài)。單線(xiàn)態(tài)與三線(xiàn)態(tài)12 MgMg的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)1st激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)3s3p12-1212-121221S

11、JnL+2S+1=12S+1=12S+1=3內(nèi)量子數(shù)內(nèi)量子數(shù)J有有2S+1個(gè)取值個(gè)取值(L+S),(L+S-1),(|L-S|)L=l 0 (用用S表示表示) 1(用用P表示表示) 1J=LS 0 1 2, 1, 0 103S113 P313 P303 P323 P光光 譜譜 項(xiàng)項(xiàng) 21SJnL+單重態(tài)單重態(tài)(singlet state) 如果分子中一對(duì)電子為自旋反平行，則如果分子中一對(duì)電子為自旋反平行，則S=0，M=1，這這種態(tài)被稱(chēng)為單重態(tài)或單線(xiàn)態(tài)，用種態(tài)被稱(chēng)為單重態(tài)或單線(xiàn)態(tài)，用S表示。表示。 大多數(shù)化合物分子處于基態(tài)時(shí)大多數(shù)化合物分子處于基態(tài)時(shí)電子自旋總是成對(duì)的，所以是單線(xiàn)態(tài)，電子自旋總是

12、成對(duì)的，所以是單線(xiàn)態(tài)，用用S S0 0表示。表示。 在吸收光子后，被激發(fā)到空軌道在吸收光子后，被激發(fā)到空軌道上的電子，如果仍保持自旋反平行狀上的電子，如果仍保持自旋反平行狀態(tài)，則重度未變，按其能量高低可相態(tài)，則重度未變，按其能量高低可相應(yīng)表示為應(yīng)表示為S S1 1態(tài)態(tài)S S2 2態(tài)態(tài)。三重態(tài)三重態(tài)(triplet state) 當(dāng)處于當(dāng)處于S S0 0態(tài)的一對(duì)電子吸收光子受激后，產(chǎn)生了在兩個(gè)態(tài)的一對(duì)電子吸收光子受激后，產(chǎn)生了在兩個(gè)軌道中自旋方向平行的電子，這時(shí)軌道中自旋方向平行的電子，這時(shí)S=S=1 1，M M=3=3，這種狀態(tài)稱(chēng)為這種狀態(tài)稱(chēng)為三重態(tài)或三線(xiàn)態(tài)三重態(tài)或三線(xiàn)態(tài)。 因?yàn)樵诖艌?chǎng)中，電子

13、因?yàn)樵诖艌?chǎng)中，電子的總自旋角動(dòng)量在磁場(chǎng)方向的總自旋角動(dòng)量在磁場(chǎng)方向可以有三個(gè)不同值的分量，可以有三個(gè)不同值的分量，是三度簡(jiǎn)并的狀態(tài)，用是三度簡(jiǎn)并的狀態(tài)，用T T表表示。按能量高低可表示為示。按能量高低可表示為T(mén) T1 1, ,T T2 2激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)。Multiplicities:S0 - common, diamagnetic (not affected by B fields)D0 - unpaired electron, many radicals, two equal energy statesT1 - rare, paramagnetic (affected by B fields

14、) (T0 - doesnt exist, not ground state)Energy(S1)Energy(T1) (difference is energy required to flip electron spin)單重態(tài)與三重態(tài)的能級(jí)比較單重態(tài)與三重態(tài)的能級(jí)比較 在三重態(tài)中，處于不同軌道的兩個(gè)電子自旋平行，兩個(gè)電子在三重態(tài)中，處于不同軌道的兩個(gè)電子自旋平行，兩個(gè)電子軌道在空間的交蓋較少，電子的平均間距變長(zhǎng)，因而相互排斥軌道在空間的交蓋較少，電子的平均間距變長(zhǎng)，因而相互排斥的作用減低，所以的作用減低，所以T T態(tài)的能量總是態(tài)的能量總是低于低于相同激發(fā)態(tài)的相同激發(fā)態(tài)的S S態(tài)能量。態(tài)能

15、量。T3T2T1S3S2S1S0S0激發(fā)到激發(fā)到S S1 1和和T T1 1態(tài)的概率態(tài)的概率 電子由電子由S S0 0態(tài)激發(fā)到態(tài)激發(fā)到S S1 1態(tài)或態(tài)或T T1 1態(tài)的概率是很不相同的。態(tài)的概率是很不相同的。 從光譜帶的強(qiáng)弱看，從從光譜帶的強(qiáng)弱看，從S0態(tài)激發(fā)到態(tài)激發(fā)到S1態(tài)是自旋允許的，態(tài)是自旋允許的，因而譜帶很寬；而從因而譜帶很寬；而從S0態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)到到T1態(tài)是自旋禁阻的，一般很態(tài)是自旋禁阻的，一般很難發(fā)生，它的概率是難發(fā)生，它的概率是10-5數(shù)量級(jí)。數(shù)量級(jí)。 但對(duì)于順磁物質(zhì)，激發(fā)到但對(duì)于順磁物質(zhì)，激發(fā)到T T1 1態(tài)的概率將明顯增加。態(tài)的概率將明顯增加。 分子吸收光子后各種光物理過(guò)程

16、可用分子吸收光子后各種光物理過(guò)程可用Jablonski雅布倫斯基雅布倫斯基圖表示。當(dāng)分子得到能量后，可能激發(fā)圖表示。當(dāng)分子得到能量后，可能激發(fā)到各種到各種S和和T態(tài)，到態(tài)，到S態(tài)的電子多于到態(tài)的電子多于到T態(tài)的電子。態(tài)的電子。2.2.2分子的活化與去活化去活化過(guò)程去活化過(guò)程注意點(diǎn)注意點(diǎn) (1)(1)氣相分子中易觀察到以發(fā)射光子方式失去振動(dòng)能氣相分子中易觀察到以發(fā)射光子方式失去振動(dòng)能(2)(2)實(shí)現(xiàn)內(nèi)部轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)內(nèi)部轉(zhuǎn)換 a.Sa.S1 1，S S2 2 電子能級(jí)差小電子能級(jí)差小 、易實(shí)現(xiàn)。、易實(shí)現(xiàn)。 b.Sb.S1 1，S S2 2 振動(dòng)能級(jí)的位能面有交叉振動(dòng)能級(jí)的位能面有交叉(3)(3)體系間

17、跨越的必要條件體系間跨越的必要條件 a. Sa. S1 1、T T1 1位能面在某處有容易達(dá)到的能量相交位能面在某處有容易達(dá)到的能量相交 b. b. 微觀磁場(chǎng)的微觀磁場(chǎng)的微擾微擾存在存在 帶電粒子的極性分子或可極化分子易產(chǎn)生磁效應(yīng)帶電粒子的極性分子或可極化分子易產(chǎn)生磁效應(yīng)或離子外層電子云疏松或離子外層電子云疏松 順磁性分子順磁性分子 O O22外層外層3 3d d5 5五個(gè)電子不成對(duì)五個(gè)電子不成對(duì) (4)(4)外部轉(zhuǎn)換使發(fā)光熄滅現(xiàn)象外部轉(zhuǎn)換使發(fā)光熄滅現(xiàn)象 T T1 1 S S0 0 比比 S S1 1 S S0 0 可能性更大可能性更大 (5)(5)去活化眾多過(guò)程中，以速度最快、激發(fā)壽命最短的

18、途徑占優(yōu)勢(shì)，去活化眾多過(guò)程中，以速度最快、激發(fā)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)，相互競(jìng)爭(zhēng)。相互競(jìng)爭(zhēng)。 傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷分子的活化與去活化Ground StateElectronsS1 excited stateS2 excited stateAbsorbance energyFluorescencenanosecondsAbsorptionfemtosecondsNonradiative dissipationBlue ExcitationInternal Conversionn（1）振動(dòng)弛豫(Vibration relaxation，簡(jiǎn)寫(xiě)為V

19、R）：當(dāng)分子吸收光輻射后可能從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)(v=0)躍遷到激發(fā)單重態(tài)Sn的較高振動(dòng)能級(jí)上。然后，在液相或壓力足夠高的氣相中，分子間的碰撞幾率很大，分子可能將過(guò)剩的振動(dòng)能量傳遞給周?chē)h(huán)境，自身從激發(fā)態(tài)的高振動(dòng)能級(jí)躍遷至能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)上。n（2）內(nèi)部轉(zhuǎn)移(Internal conversion，簡(jiǎn)寫(xiě)為IC)：當(dāng)高電子能級(jí)中的低振動(dòng)能級(jí)與低電子能級(jí)中的高振動(dòng)能級(jí)發(fā)生重疊時(shí)，常發(fā)生電子從高電子能級(jí)以無(wú)輻射躍遷形式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)。如圖中，S2和T2中的低振動(dòng)能級(jí)與S1和T1中的高振動(dòng)能級(jí)重疊，電子可的通過(guò)振動(dòng)能級(jí)的重疊從S2躍遷至S1，或從T2躍遷至T1。分子吸收輻射能后不管激發(fā)到哪一個(gè)激發(fā)

20、單重態(tài)，都能通過(guò)振動(dòng)弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移而躍遷到最低(第一)激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。n（3）熒光發(fā)射(Fluorescence emission,FE)：處于激發(fā)單重態(tài)的電子經(jīng)振動(dòng)弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移后到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的最低振動(dòng)能級(jí)(v=0)后，以輻射的形式躍遷回基態(tài)(S0)的各振動(dòng)能級(jí)。經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)移的能量損失，熒光發(fā)射的能量比分子吸收的能量要小，熒光發(fā)射的波長(zhǎng)比分子吸收的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。第一發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的平均壽命得為109104S，因此熒光壽命也在這一數(shù)量級(jí)。n（4）系間跨躍(Intersysitem Crossing, ISC)：不同多重態(tài)之間的無(wú)輻射躍遷過(guò)程，它涉及到受激發(fā)電

21、子自旋狀態(tài)的改變。圖中S1的最低振動(dòng)能級(jí)與T1的較高振動(dòng)能級(jí)重疊，就有可能通過(guò)自旋一軌道偶合等作用實(shí)現(xiàn)這一躍遷。系間跨躍的速度很小，經(jīng)歷的時(shí)間較長(zhǎng)。n（5）磷光發(fā)射(Phosphorescence emission,PE)：激發(fā)態(tài)的電子經(jīng)系間跨躍后到達(dá)激發(fā)三重態(tài)，經(jīng)過(guò)迅速完成的振動(dòng)弛豫而躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后以輻射形式躍遷回基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)。磷光波長(zhǎng)比熒光波長(zhǎng)要長(zhǎng)。T1還可能通過(guò)熱激發(fā)而重新躍回S1即T1S1，然后再由S1經(jīng)輻射躍遷回S0，發(fā)出熒光，這種熒光稱(chēng)為延遲熒光。n（6）外部轉(zhuǎn)移(External convertion,EC)：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子溶質(zhì)分子相互碰撞，并

22、發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的過(guò)程。外部轉(zhuǎn)移能使熒光或磷光的強(qiáng)度減弱甚至消失，這種現(xiàn)象稱(chēng)為猝滅或熄滅。 .3. . 熒光類(lèi)型熒光類(lèi)型 從壽命從壽命 瞬時(shí)熒光瞬時(shí)熒光 1010-8-8s s 內(nèi)發(fā)射內(nèi)發(fā)射 分析中有意義分析中有意義! S S1 1S S0 0+ + h S S1 1+ +S S0 0 ( (S S1 1 S S0 0) ) 22S S0 0+ + h 受激準(zhǔn)分子（受激準(zhǔn)分子（excimer） 遲滯熒光遲滯熒光 波長(zhǎng)同瞬時(shí)熒光，壽命與磷光相似剛性、粘稠介質(zhì)中波長(zhǎng)同瞬時(shí)熒光，壽命與磷光相似剛性、粘稠介質(zhì)中 E型型 T T1+ 活化能活化能 S S1 1S S0 0+ + h P 型型

23、 T T1 + T T1 S S1 1 + + S S0 0 三重態(tài)三重態(tài)三重態(tài)粒子湮沒(méi)三重態(tài)粒子湮沒(méi) S S0 0+ + h 壽命為相隨磷光壽命的壽命為相隨磷光壽命的 1/2 復(fù)合復(fù)合(重組）重組）A()+ h 1 A A( () ) + h 2 A A. .+ +( ( ) +) +e e 重組重組+e A()+ h 3 A A( ( ) )Three types of delayed fluorescence are known:(i)E-type delayed fluorescence: The first excited singlet state becomes populate

24、d by a thermally activated radiationless transition from the first excited triplet state. Since in this case the population of the singlet and triplet states are in thermal equilibrium, the lifetimes of delayed fluorescence and the concomitant phosphorescence are equal. T1 S1 S0 h(ii) P-type delayed

25、 fluorescence: The first excited singlet state is populated by interaction of two molecules in the triplet state (triplet-triplet annihilation) thus producing one molecule in the excited singlet state. In this biphotonic process the lifetime of delayed fluorescence is half the value of the concommit

26、ant phosphorescence. T1 T1 S1 S0 S1 S0 h(iii) Recombination fluorescence: The first excited singlet state becomes populated by recombination of radical ions with electrons or by recombination of radical ions of opposite charge.2.3 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜*MXMX+ + = =n1iihv = =+ +n1jjhvMXMX*Excitation and emissi

27、on spectraExcitation and emission spectra 1 2 3 4Excitation spectrumEmission spectraF F em200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044

28、004800 IF s0s1ExcitationFluorescenceT1kiscPhosphorescence 溶液熒光光譜的特征（1 1）斯托克斯位移）斯托克斯位移( (Stokes shift)n在溶液熒光光譜中，觀察到的熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)，這種波長(zhǎng)位移現(xiàn)象稱(chēng)為斯托克斯位移。Emission is at longer wavelength (lower energy) than excitation due to energy losses.em ex = Stokes shift495 nm520 nmStokes Shift is 25 nmFluoresceinmole

29、culeFluorescnece IntensityWavelength 產(chǎn)生Stokes位移的主要原因：首先，由于振動(dòng)弛豫及內(nèi)都轉(zhuǎn)移的無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子而迅速衰變到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；其次，不同振動(dòng)能級(jí)也發(fā)生振動(dòng)弛豫至最低振動(dòng)能級(jí)，也造成能量的損失；第三，溶劑效應(yīng)和激發(fā)態(tài)分子可能發(fā)生了某些反應(yīng)，也會(huì)加大斯托克斯位移。n（2 2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)n 熒光發(fā)射的產(chǎn)生原理，所以不管激發(fā)光的能量多大，能把電子激發(fā)到何種激發(fā)態(tài)，都將經(jīng)過(guò)迅速的振動(dòng)弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)的最低能級(jí)，然后發(fā)射熒光。熒光光譜只有一個(gè)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)

30、無(wú)關(guān)的發(fā)射帶。（3 3）吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜的形狀相近似，）吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜的形狀相近似， 吸收光譜與熒吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜成鏡像關(guān)系光激發(fā)發(fā)光譜成鏡像關(guān)系 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)能級(jí)分布類(lèi)似；基態(tài)上的零似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。大，相反躍遷也然。nOften, but not always presentnThought to be due to the fact that if 0n vibrati

31、on transition most likely on absorption, then the same most likely on emission.吸收光譜與發(fā)射光譜中0-0振動(dòng)帶具有相同的能量，但兩者的峰波長(zhǎng)并不重合，發(fā)射的0-0帶略向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。這是由于激發(fā)態(tài)的電子分布不同于基態(tài)，偶極矩和極化率也有所不同。室溫下，溶液中的溶劑分子在吸光過(guò)程中來(lái)不及重新定向，分子在激發(fā)后的瞬間仍處于一種比平衡條件下具有稍高能量的溶劑化狀態(tài)。在熒光發(fā)射之前，分子將有時(shí)間松弛到能量較低的平衡構(gòu)型。熒光發(fā)射后的瞬間，返回基態(tài)的分子的溶劑化狀態(tài)還是處于處于能量稍高的非平衡態(tài)，最后又松弛到基態(tài)的平衡構(gòu)型。

32、吸光能量略高于光發(fā)射過(guò)程所釋放的能量。兩者的能量差在松弛過(guò)程中以熱的形式傳遞給溶劑。吸收 h 熒光 h0-0 0-0激發(fā)和發(fā)射后溶劑化的變化0 02020404060608080100100120120-5-55 515152525353545455555t/nst/nsN N/0)()(tetNtN-=lDefinitionLifetime for Single molecule: the time the molecule spends in the excited state prior to return to the ground state. Average lifetime: t

33、he average time the molecule spends in the excited state prior to return to the ground state. Average fluorescence lifetime etNNt1)()(,0=2.4 2.4 熒光壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命和量子產(chǎn)率熒光的衰變通常是屬于單指數(shù)衰變過(guò)熒光的衰變通常是屬于單指數(shù)衰變過(guò)程，在程，在t= t= 之前有之前有6363的激發(fā)分子已的激發(fā)分子已經(jīng)衰變了，經(jīng)衰變了，3737的激發(fā)分子則在的激發(fā)分子則在 t t 的時(shí)刻衰變的。的時(shí)刻衰變的。lExpressionExpression nr

34、k +=1relaxation (10-12 s)S0S1S1hvAhvF knrSimplified Jablonski diagram : Emission rate Knr: nonradiative decay rateLifetimeIntrinsic or natural lifetime(本征壽命本征壽命)10=The lifetime of the fluorophore in the absence of nonradiative processes is called the intrinsic lifetime.n熒光分子的平均壽命與躍遷的許可性?xún)烧咧g的關(guān)系大致表熒光分

35、子的平均壽命與躍遷的許可性?xún)烧咧g的關(guān)系大致表示如下：示如下：n 10-5/ max nS0 S1， 值約值約103 m2 mol-1，熒光壽命大致為熒光壽命大致為10-8snS0 T1， 值約值約10-3 m2 mol-1 ，磷光壽命大致為磷光壽命大致為10-2sn熒光強(qiáng)度的衰變，通常將遵從如下速率方程式：熒光強(qiáng)度的衰變，通常將遵從如下速率方程式：nlnI0-lnIt = -t/ n式中式中I0和和It分別表示分別表示t0和和tt時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量不同時(shí)刻時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量不同時(shí)刻t t所相應(yīng)的所相應(yīng)的I It t值，并作出值，并作出lnItt的關(guān)系曲線(xiàn)，其結(jié)果將得到一條

36、直線(xiàn)，由的關(guān)系曲線(xiàn)，其結(jié)果將得到一條直線(xiàn)，由該直線(xiàn)的斜率便可求得熒光壽命的數(shù)值。該直線(xiàn)的斜率便可求得熒光壽命的數(shù)值。n熒光壽命測(cè)定的現(xiàn)代方法熒光壽命測(cè)定的現(xiàn)代方法: :n時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法（Time-Correlated Single-Photon counting,TCSPC）; ;n相調(diào)制法相調(diào)制法（Phase modulation methods）; ;n頻閃技術(shù)頻閃技術(shù)（Strobe Techniques）。 nTCSPCTCSPC是目前主要應(yīng)用的熒光壽命測(cè)定技術(shù)。是目前主要應(yīng)用的熒光壽命測(cè)定技術(shù)。nRefRef：房喻，王輝；熒光壽命測(cè)定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用；熒光壽命

37、測(cè)定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用；化學(xué)通報(bào)；2001，10，631-6362.5 fluorescence quantum yieldnrk+=lDefinition The fluorescence quantum yield is the ratio of the number of photons emitted to the number absorbed lExpression lRelationship with lifetimenrk +=110=0=lDeterminationComparison with a standard1. Chose a Standard with a quan

38、tum yield s2. At I determine the absorption (As) of the standard3. At ex = I excited the standard, and integrate the emission spectrum of standard, get F4. Repeat 3th step with the blank solvent. Minus the emission from blank, get FsF 5. Repeat 2-4th steps with the sample, and get Ax and FxsxxSsxFFA

39、A=Quantum Yield Standards Estimate quantum yield of fluorophore comparison of fluorophore with known quantum yield Q = QR (I/IR) (ODR/OD)(n2/n2R) Refractive index intensity observed from a point source is modified by (n/n0)2lChoose StandardsEnough absorbance both standard and sample at chosen excite

40、d wavelength.Moderate quantum yield.1. 0.05 mol / L sulfate of quinine, = 0.55 Examples 2. RuPy3Cl2, deoxygenated solution, 20 C, = 0.042NNNNNNRu2+2Cl-2.6 Fluorescence Anisotropyand Fluorescence Polarization光是一種電磁波，具有相位相同的兩個(gè)互相垂直的振動(dòng)矢量，光是一種電磁波，具有相位相同的兩個(gè)互相垂直的振動(dòng)矢量，電矢量和磁矢量電矢量和磁矢量l光的性質(zhì)光的性質(zhì)EHl偏振光偏振光l非偏振光非偏

41、振光Principle of photoselective excitation Information about the size and shape of proteins or rigidity of various molecular environments.Fluorophores preferentially absorb photons whose electric vectors are aligned parallel with transition moment of the fluorophore. In an isotropic solution, fluoroph

42、ores are oriented randomly. Upon excitation with polarized light, one selectively excites those fluorophore molecules whose absorption transition dipole is parallel to the electric vector of the excitation. This selective excitation results in partially oriented population of fluorophores and in par

43、tially polarized fluorescence emission. z激發(fā)偏振器激發(fā)偏振器發(fā)射偏振器發(fā)射偏振器xy檢測(cè)器檢測(cè)器IIlDefinition 0 . 1, 0=PrI0,11=PrII+-=IIIIPIIII+-=IIIIr2IIIIpolarization熒光偏振熒光偏振anisotropy各項(xiàng)異性各項(xiàng)異性5 . 0, 4 . 0PrFor fluorophore完全偏振光，散射光才能達(dá)到完全偏振光，散射光才能達(dá)到自然光或非偏振光Where I| and I are the fluorescence intensities of the vertically (|)

44、and horizontally( ) polarized emission, when the sample is excited with vertically polarized light. Polarization and anisotropyrrP+=23PPr-=32熒光偏振與熒光各向異性可通過(guò)以下公式相互轉(zhuǎn)換：熒光偏振與熒光各向異性可通過(guò)以下公式相互轉(zhuǎn)換：當(dāng)體系中存在多種熒光體時(shí)，所測(cè)得的熒光各向異性是各當(dāng)體系中存在多種熒光體時(shí)，所測(cè)得的熒光各向異性是各種熒光體熒光各向異性的平均值：種熒光體熒光各向異性的平均值： =iiirfr2.7 2.7 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與

45、溶液濃度的關(guān)系shiftstokesPremex,Principle of quantitative and qualitative analysis by fluorometrylQualitative probing parameters: lQuantitative determination bcIF303.20=紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量池(吸收池)I0ItI0ItIF,pbC303. 20teT,bCIIlgTlgA - -= = =- -= =- -= =bC303.20te1T1II1- - -= =- -= =- -)e1(IIIbC303.20t0- - -= =- -)e1

46、(I)II(IbC303.20t0F- - -= =- -= = !nx!4x!3x!2x!1x1en432x+ + + + + + + += =)!4)bC30. 2(!3)bC30. 2(!2)bC30. 2(bC30. 2(II4320F + +- - - -+ +- - -= = CbIk30. 2I0FF = =CbIk30. 2I0PP = =CKIF= =KCIP= =一般當(dāng)一般當(dāng)b c 0.05 時(shí)時(shí), F 與與c呈線(xiàn)性關(guān)系呈線(xiàn)性關(guān)系Fc*hvhvDDDD+ + +D)(DDD11*+ +2.7 2.7 熒光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用熒光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用靈敏度高靈敏度高：測(cè)定下限：測(cè)

47、定下限01 0.001 g/mL,g/mL, 比分光光度法高比分光光度法高2 24 4個(gè)數(shù)量級(jí)。個(gè)數(shù)量級(jí)。（在黑背景下檢測(cè)；光源的強(qiáng)度大）（在黑背景下檢測(cè)；光源的強(qiáng)度大）選擇性高選擇性高：適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)和熒光測(cè)定的波長(zhǎng)；應(yīng)用適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)和熒光測(cè)定的波長(zhǎng)；應(yīng)用熒光壽命的差別熒光壽命的差別時(shí)間分辨技術(shù)。時(shí)間分辨技術(shù)。 熒光測(cè)定的選擇性熒光測(cè)定的選擇性蒽的激發(fā)和發(fā)射光譜蒽的激發(fā)和發(fā)射光譜菲菲和和蒽蒽的熒光光譜的熒光光譜（激發(fā)波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng) 265 nm) 蒽蒽菲菲 菲在菲在360 nm以上無(wú)吸收，用以上無(wú)吸收，用365 nm激發(fā)光時(shí)，菲無(wú)熒光，激發(fā)光時(shí)，菲無(wú)熒光，可以

48、在可以在400 nm測(cè)定蒽的熒光。測(cè)定蒽的熒光。 在在265 nm, 蒽和菲均有吸收，蒽和菲均有吸收，以此波長(zhǎng)的光激發(fā)，在以此波長(zhǎng)的光激發(fā)，在350 nm只有菲有熒光，故可測(cè)定菲。只有菲有熒光，故可測(cè)定菲。MFS與與UV/Vis 法比較：法比較： 原理原理UV/Vis 吸收吸收MFS 發(fā)射發(fā)射測(cè)定方法測(cè)定方法I0ItF靈敏度靈敏度, 選擇性選擇性10-510-6molL-110-710-9 molL-1I0F 熒光光度法的應(yīng)用熒光光度法的應(yīng)用生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測(cè)生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測(cè). .n直接測(cè)定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)直接測(cè)定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì). .nIntrinsic

49、 fluorophores are those which occur naturally 帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸( (Tryptophan) )、酪氨酸、酪氨酸( (Tyrosine) )、苯基丙氨酸、苯基丙氨酸( (Phenylalanine).).Protein fluorescenceProtein fluorescenceH2NCH CCH2OHOIndole group of tryptophan 色氨酸中的吲哚基團(tuán)色氨酸中的吲哚基團(tuán)H2NCH CCH2OHOHN ex = 280, em = 340, highly sensitive to solvent polarityH2NCH CCH2OHOOHtyrosinePhenylalanine TyrosinePhenylalanineTryptophanIntrinsic FluorescenceFluorescence spectra lie in the UV region The spectra for both Tyr and Trp are extremely sensitive to local environmentSolventAmino AcidPolypeptide Emission Quantum Emission Quantum Phen