酵母實驗文獻_實驗全過程1.

1、實驗全過程實驗全過程張宇張宇載體載體LB提質(zhì)粒提質(zhì)粒酶切酶切T4酶連接酶連接篩選篩選重組子重組子酵母酵母感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞酵母轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)培養(yǎng) 釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備（釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備（Thompson，1998） 1. 從YPD平板上培養(yǎng)的酵母菌落中挑取單菌斑，接種于10mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30下180rpm 振蕩培養(yǎng)1824h。 2. 取1mL 過夜培養(yǎng)菌液接種于50mL新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中， 30下180rpm振蕩培養(yǎng)810h至OD600 0.300.35 3. 取出，于冰上放置15min使細胞停止生長；將菌液轉(zhuǎn)至無菌的50mL離心管中， 4,30

2、00rpm 離心5min，去上清，收集酵母細胞。 4. 加入50mL無菌水，重懸菌體，4,3000rpm 下離心5min，去上清。 5. 8mL無菌水重懸菌體，加入10mL 10XTE 緩沖液，搖勻后，再加入10mL 10XLiAC緩 沖液，搖勻后，30下180rpm振蕩培養(yǎng)45min。 6. 加入1M的DTT至濃度為25mM：混合均勻后30下180rpm振蕩培養(yǎng)15min。 7. 將酵母菌懸液稀釋在50mL的ddH2O中，4下3000rpm 離心5min，去上清。 8. 依次重懸細胞，前兩次里懸后下4下3000rpm 離心5min，去上淸，所用溶液如下： 第一次重懸：25mL冰冷的ddH2O

3、 第二次重懸：25mL冰冷的1M山梨醇第三次重懸：1mL冰冷的1M山梨醇 *每次重懸后，應(yīng)劇烈吹打細胞沉淀，使得細胞能夠完全分散幵，最后重懸酵母菌體積 應(yīng)在1.01.5mL之間。 （選自 共表達_1_3_1_4_葡聚糖酶_省略_釀酒酵母的構(gòu)建及其性能的應(yīng)用研 究_魯健章 浙江大學(xué) 博士學(xué)位 論文 P60）酵母感受態(tài)制備酵母感受態(tài)制備1. 將活化的NYK菌株從平板上接入5mLYPD 液體培養(yǎng)基中，250rpm 30過 夜培養(yǎng)。2. 以0.5%接種量轉(zhuǎn)接至200mL YPD培養(yǎng)基中（為了保證足夠的氧氣供應(yīng)，使 用1L 的三角瓶） 搖瓶過夜至1.01.3。3. 3000rpm 4下，離心5min，離

4、心，收集細胞沉淀，重懸于200mL冰冷的無菌水。4. 3000rpm 4下，離心5min，收集細胞沉淀，重懸于100mL冰冷的無菌水。5. 3000rpm 4下，離心5min，收集細胞沉淀，重懸于8mL冰冷的1mol/L山 梨醇溶液。6. 3000rpm 4下，離心5min，收集細胞沉淀，重懸于1mL冰冷的1mol/L山梨醇溶液。分裝，80l管，即為感受態(tài)細胞。-80存。(選自 多基因轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組工業(yè)釀酒酵母及其在木薯酒精發(fā)酵中的應(yīng)用研究_陽辛鳳 海南大學(xué) 博士論文 P44) 酵母酵母YPH501感受態(tài)細胞的制備感受態(tài)細胞的制備1. 挑取YPH501單菌落,30振蕩培養(yǎng)過夜2. 取過夜培養(yǎng)的菌

5、液1%接種于40mL LB液體培養(yǎng)基中,30震蕩培 養(yǎng)至OD600約為0.6。3. 菌液轉(zhuǎn)移至離心管,離心,3600r/min離心6min，棄上清4. 加入40mL 1xTE ,小心重懸沉淀,3600r/min離心6min,棄上清5. 加入20mL 1xTE ,小心重懸沉淀,3600r/min離心6min,棄上清6. 加入2mL 1xLi Ac/0.5 xTE ,室溫放置10min。7. 將感受態(tài)細胞分裝于預(yù)冷的無菌離心管中(200L 每管),-70保 存（選自 青蒿素前體合成酵母工程菌構(gòu)建及發(fā)酵產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化研究_曾麗香 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 碩士論文 P33） 酵母菌完整細胞轉(zhuǎn)化法酵母菌完整細胞轉(zhuǎn)

6、化法1. 將受體菌接種于 YEPD 斜面培養(yǎng)基活化一次2. 從活化的斜面上取一環(huán)菌體接種于 2m L YEPD 液體培養(yǎng)基中，28振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期 （約 1216h）3. 4000g 離心 30 秒收集菌體，用 TE 洗一次4. 用 0.1mol/L Li Ac-0.01mol/L TE 溶液懸浮菌體，加入 10g 小牛胸腺 DNA，0.01g 質(zhì)粒 DNA，700L PEG4000 溶液，充分混勻后于 28保溫處理 1h；5. 42熱沖擊處理 25min;6. 待轉(zhuǎn)化液溫度降至室溫后，取 200L 轉(zhuǎn)化液與 15m L 保溫在 4548的選擇培養(yǎng)基混合 后倒平板，28培養(yǎng) 34d 長出轉(zhuǎn)化子

7、。（選自酒酒球菌mleA和mleP基因的克隆及其在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)化與表達_劉延琳 西北農(nóng)林科技大學(xué) 博士論文 P63） PEG/Li Ac 誘導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化 收集一定量( 約10 107) 感受態(tài)細胞，用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體 2 次，加入 1 m L 不同預(yù)冷的處理液將菌體重懸，冰上放置10 min，離心，完全去上清，加入 1 2 L( 約 200 ng) 待轉(zhuǎn)化 DNA 和冰預(yù)冷的 0.1 mol/L Li Ac ( 總體積為 16L) 重 懸 細 胞，加 入 PEG ( 50% ) 60 L; 5 Lithiumacetate( 1 mol / L) 9 L; 6 HS DNA

8、( 10 mg / m L) 5 L; 7Total 74 L，配制好的 PEG / Li Ac mix 經(jīng)過漩渦振蕩器高速振蕩 10 s 后，30 孵育 30 min 漩渦振蕩器高速振蕩 10 s 后，42 孵育 13 15 min，熱激后收集菌體并重 懸 于 1 m L 新 鮮 YPD，30 ，200 r/min 孵 育90 min; 取 10 15 L 滴 SC-Ura 的平板。30 培養(yǎng) 48h，計數(shù)轉(zhuǎn)化子克隆數(shù)并算出轉(zhuǎn)化效率。 （選自釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法的新探索 實驗室研究與探索2012年 第31卷 第4期） 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pESC-HIS-4CL對釀酒酵母的轉(zhuǎn)化對釀酒酵母的轉(zhuǎn)化 釀酒

9、酵母感受態(tài)細胞的制備 主要試劑:1M LiCL,50%PEG -3350,2mg/ml鮭魚精（用TE溶解,超聲波破碎） 實驗步驟：1. 在50mlYPAD培養(yǎng)基中30振蕩培養(yǎng)釀酒酵母細胞至OD600約為0.81.0（108細胞/ml）2. 收獲細胞,并用25ml無菌水沖洗,然后1500Xg室溫離心10min.3. 棄去上清,用1ml 100mM LiCL重懸細胞4. 將細胞懸液轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中5.最高速離心15s,移去上清6. 用400L 100mM LiCL重懸細胞7. 將細胞懸液以每管50L分裝至1.5ml離心管中8. 將1ml DNA 單體樣品沸水中煮5min,置冰上快速冷卻。9.

10、 將第7步細胞懸液離心,棄去上清。10. 分別在離心管中加入240L 50%PEG、36L 1M LiCL、 25Lmg/ml DNA單體、質(zhì)粒5-10g, 然后充分混勻。11. 30靜置30min。12. 42熱激20-25min。13. 6000-8000rpm離心1min。14. 用1ml 無菌水重懸。15. 取20-100L涂布營養(yǎng)缺陷型SD-HIS平板上,30培養(yǎng)2-3天,直 到轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。（選自釀酒酵母生產(chǎn)白藜蘆醇關(guān)鍵酶基因4CLcDNA的克隆與轉(zhuǎn)化_王永智 西北大學(xué) 碩士論文 P29） 釀酒酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化釀酒酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化1. 挑取酵母 H1246 的單菌落到 1

11、0m L 的 YPD 培養(yǎng)基，30、180rpm培養(yǎng) 12h。2. 使用紫外分光光度計測定上述培養(yǎng)物 OD600，轉(zhuǎn)接到 50m L YPD 液體培 養(yǎng)基培養(yǎng) 3h，重新測定培養(yǎng)物的 OD600至 0.4-0.6（不得小于 0.4，否則 影響轉(zhuǎn)化效率）。3. 2500rpm 離心菌液 5min，用 40m L 的 1TE 重懸細胞。4. 2500rpm 離心 5min 棄上清，加入 2m L 的 1Li AC/0.5TE。5. 室溫培養(yǎng)細胞 10min。6. 接入 10u L 質(zhì)粒（PYES2-1、PYES2-2、PYES2-3 載體）、10u L 的 10g/L的 ss DNA，上下震蕩離心

12、管 5-6 次。7. 加入 700u L 的 1Li AC/40%PEG-3350/1TE，混合均勻。8. 在 30下 200rpm 培養(yǎng) 30min。9. 加入 88u L DMSO 混合均勻，42熱激 7 分鐘。10. 冰上放置 1-2min。11. 室溫下 14000rpm 離心 5-10s，棄上清。12. 取 1TE100u L 重懸細胞涂布于 SD-U 平板，30倒置培養(yǎng)（2-4d） 直到長出酵母單克隆。13. 挑取 5-10 個單克隆劃線培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接 SD-U 液體培養(yǎng)基提取質(zhì)粒 檢測。（選自 花生油脂代謝關(guān)鍵基因在酵母和聚球藻中表達及功能驗證_孫嬌嬌哈工大 碩士論文 P87 ）酵母

13、轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化 1. 接種 5 ml 液體 YPD，30 下振蕩培養(yǎng)過夜；2. 計數(shù)過夜培養(yǎng)物細胞密度。以最終 5106/ml 的細胞密度接種 100 ml YPD培 養(yǎng)基；3. 置 30 ，200 rpm/min 振蕩培養(yǎng)至 2107/ml，通常需要 35 小時；4. 用 50 ml 無菌離心管以 3000g 離心 5 min，收獲細胞；5.棄培養(yǎng)液，懸浮細胞于 25 ml 無菌水中，在同上離心；6.棄水，把細胞懸浮在 1 ml 的 100 mmol/L 的醋酸鋰中，轉(zhuǎn)懸浮物到一個無菌 1.5 ml 的離心管中；7.離心 5 sec 沉淀細胞，吸出醋酸鋰；8.懸浮細胞至終體積 500 l 體積

14、，其中大約含有 400 l 的 100 mmol/L 醋酸鋰；9.將 1 ml 單鏈擔(dān)體 DNA 樣品煮沸 5 分鐘，快速在冰水中冷卻； 10.振蕩細胞懸浮液，取 50 l 樣品加到標記的離心管中，離心沉淀細 胞，除去醋酸鋰；11.按照下列成份配置“轉(zhuǎn)化混合液”：240 l PEG（50） 36 l 1.0 mol/L 醋酸鋰25 l 單鏈載體 DNA（2.0 mg/ml）50 l 水和質(zhì)粒（0.110 g）12.劇烈振蕩每個反應(yīng)管至細胞完全混勻，通常要 1 min；13. 30 保溫 30 min；14. 42 熱激 2025 min；15. 60008000 rpm/min 離心 15 秒

15、，除去轉(zhuǎn)化混合液；16. 吸 0.21.0 ml 無菌水加到每個反應(yīng)管中，輕輕懸浮沉淀；17. 用等份的 200 l 轉(zhuǎn)化混合液涂選擇平板。（選自 大蒜重金屬抗性基因的克隆及其功能分析_張海燕 中國科學(xué)院研究生院 博士論文 P49） 畢赤酵母表達載體的轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達載體的轉(zhuǎn)化 SalISalI質(zhì)粒線性化質(zhì)粒線性化：分別取10g重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SalI線性化，37酶切過夜，取少量進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否酶切完全，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10L無菌水中。 畢赤酵母畢赤酵母X33X33感受態(tài)細胞的制備：感受態(tài)細胞的制備：將畢赤酵母X33接種于5ml YPD 液體培養(yǎng)基中，2

16、50rpm 30過夜培養(yǎng)。取少量上述培養(yǎng)物接種于50ml YPD液體培養(yǎng)基中，250rpm 30培養(yǎng)至OD600達到0.8-1.0；4 4000rpm 離心5min收集菌體。用25ml無菌水清洗菌體，4000rpm 4離心10min，棄上清。在1ml 的100mM LiCL中重懸細胞，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。最大轉(zhuǎn)速離心15s，吸盡LiCL。用400L 100mM LiCL重懸細胞，取50L細胞懸浮物分裝于1.5ml離心管中，立即使用。 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化畢赤酵母的轉(zhuǎn)化：將1ml單鏈魚精DNA在沸水中煮5min后放置到冰上使其迅速冷卻。將畢赤酵母X33感受態(tài)細胞在，4000rpm 4離心5min，吸盡管內(nèi)的LiCL液體。按順序加入下列試劑至感受態(tài)細胞中：204L 50%PEG-3350，36L 1M LiCL,25L 2mg/mL單鏈魚精DNA，50L線性