微生物限度檢查法

1、 微生物限度檢查法微生物限度檢查法 江蘇省蘇州藥品檢驗所細菌、細菌、 霉菌（酵母菌）霉菌（酵母菌） 計數(shù)計數(shù)n1簡述（簡述（微生物限度檢查的意義微生物限度檢查的意義）n細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)是檢測規(guī)定企業(yè)細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)是檢測規(guī)定企業(yè)單位內(nèi)的非滅菌制劑污染的活菌數(shù)量，是單位內(nèi)的非滅菌制劑污染的活菌數(shù)量，是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標，判定藥品受到微生物污染程度的重要指標，也是對生產(chǎn)企業(yè)的藥品、原料、輔料、設(shè)也是對生產(chǎn)企業(yè)的藥品、原料、輔料、設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù)之一。衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依

2、據(jù)之一。細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)均細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)均采用平板菌落計數(shù)法，這是采用平板菌落計數(shù)法，這是活菌計數(shù)方法之一，也是目活菌計數(shù)方法之一，也是目前國際上許多國家常用的一前國際上許多國家常用的一種方法。種方法。n該方法以在瓊脂平板上，每個細菌該方法以在瓊脂平板上，每個細菌（營養(yǎng)瓊脂）、霉菌（玫瑰紅鈉瓊（營養(yǎng)瓊脂）、霉菌（玫瑰紅鈉瓊脂）、酵母菌（玫瑰紅鈉瓊脂或酵脂）、酵母菌（玫瑰紅鈉瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂）形成一個母浸出粉胨葡萄糖瓊脂）形成一個獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。n測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長的細菌（一群在營養(yǎng)瓊脂上生長

3、的細菌（一群在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫、需氧和兼性厭氧發(fā)育的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、PH和其他因素有特殊要求的細菌、和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。霉菌和酵母菌。n一個細菌、霉菌和酵母菌菌落均可一個細菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一個或多個菌細胞形成。因此供由一個或多個菌細胞形成。因此供試品中所測的菌落數(shù)實際為菌落形試品中所測的菌落數(shù)實際為菌落形成單位數(shù)（成單位數(shù)（colony forming unit ，CFU），），而不應(yīng)理解為細菌、霉菌、而不應(yīng)理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數(shù)。酵母

4、菌的個數(shù)。微生物檢驗項目微生物檢驗項目：細菌總數(shù)測定、：細菌總數(shù)測定、霉菌與酵母菌總數(shù)測定、控制菌檢驗霉菌與酵母菌總數(shù)測定、控制菌檢驗（包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙（包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、金黃葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌）以門菌、金黃葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌）以及活螨的檢驗。及活螨的檢驗。n2.1 設(shè)備設(shè)備n2.1.1 無菌室無菌室n2 設(shè)備、儀器及用具設(shè)備、儀器及用具n2.1.1.1結(jié)構(gòu)和要求結(jié)構(gòu)和要求 無菌室應(yīng)采光良無菌室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠離廁所及污染區(qū)好、避免潮濕、遠離廁所及污染區(qū)（面積不超過（面積不超過10m2，高度不超過高度不超過2.4m）由緩沖間（由緩沖間（2個）、操

5、作間組個）、操作間組成。成。n操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)箱，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。直對。 n無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻與地面及墻壁、天花清洗消毒。墻與地面及墻壁、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形無縫隙，不留板連接處應(yīng)呈凹弧形無縫隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。n無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間均應(yīng)設(shè)勒克斯。緩沖間和操作間均應(yīng)

6、設(shè)置紫外線殺菌燈（置紫外線殺菌燈（.5W/m3），），紫外殺菌燈應(yīng)距實驗臺面高度不超過紫外殺菌燈應(yīng)距實驗臺面高度不超過1M，并應(yīng)定期檢查輻射強度，不得并應(yīng)定期檢查輻射強度，不得低于低于70W.cm-2（M距離）。不距離）。不符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時更換。符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時更換。n2.1.1.2溫度、濕度溫度、濕度 無菌室內(nèi)溫度無菌室內(nèi)溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈殺和相對濕度直接影響紫外殺菌燈殺菌效果，故溫度應(yīng)控制在菌效果，故溫度應(yīng)控制在1826，相對濕度，相對濕度4060。操作。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持對環(huán)境形成正壓、不低于對環(huán)境形成正壓、

7、不低于4.9Pa。n2.1.1.3操作間操作間 操作間應(yīng)安裝空氣操作間應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低除菌過濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低于是于是10000級，局部凈化度為級，局部凈化度為100級，或放置同等級凈化工作臺，并級，或放置同等級凈化工作臺，并準備藥物天平，乙醇燈，火柴，乙準備藥物天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳頭等。醇棉，大、小橡皮乳頭等。n2.1.1.4緩沖間緩沖間 緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。盆，無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。物。n2.1.1.5潔凈潔凈 級級 別別 及及 檢

8、檢 查方法查方法 通通常采用塵常采用塵 粒粒 數(shù)數(shù) 及及 浮浮 游游 菌菌 數(shù)數(shù) 或或 沉沉 降降 菌菌 數(shù)測數(shù)測 定定 法。法。 潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級別表潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級別表潔凈度級潔凈度級別別塵粒最大允許數(shù)塵粒最大允許數(shù) /立方米立方米 0.5m5m百級百級3，5000萬級萬級350，0002，000十萬級十萬級3，500，00020，000三十萬級三十萬級10，500，00060，000級別級別微生物最大允許數(shù)微生物最大允許數(shù) 換氣次數(shù)換氣次數(shù)/小時小時 浮游菌浮游菌/立方米立方米沉降菌沉降菌 / 皿皿 百級百級510.3米米/秒秒萬級萬級100320十萬級十萬級500101

9、5三十萬級三十萬級15-n2.1.1.5.1 浮游菌數(shù)測試方法（參照浮游菌數(shù)測試方法（參照中 人 民 共 和 國 國 家 標 準中 人 民 共 和 國 國 家 標 準GB/T16293-1996）。）。n2.1.1.5.2 沉降菌數(shù)測定沉降菌數(shù)測定(法法) n無菌室操作臺消毒擦拭處理后，先無菌室操作臺消毒擦拭處理后，先啟動層流凈化裝置啟動層流凈化裝置30min，將備妥的將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板營養(yǎng)瓊脂平板3個個(經(jīng)經(jīng)3035預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)48h，證明無菌落生長。證明無菌落生長。)以無菌方式以無菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺左、中、右各化臺左、中、右各1個，開蓋

10、，暴露個，開蓋，暴露30min后將蓋蓋上。后將蓋蓋上。 在在3035培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h，取出檢查。取出檢查。 3個平板生長的平均菌落個平板生長的平均菌落數(shù)不超過數(shù)不超過1個。個。 n無菌室操作臺或凈化工作臺要定期無菌室操作臺或凈化工作臺要定期檢測其潔凈度，應(yīng)達到檢測其潔凈度，應(yīng)達到100級。凈級。凈化工作臺中的高效及中效過濾器應(yīng)化工作臺中的高效及中效過濾器應(yīng)根據(jù)檢測情況，必要時予以更換處根據(jù)檢測情況，必要時予以更換處理。理。n2.1.1.6消毒處理消毒處理 無菌室應(yīng)在每次無菌室應(yīng)在每次操作前、后均用操作前、后均用.1%苯扎溴銨溶苯扎溴銨溶液或其他消毒液擦拭操作臺及可液或其他

11、消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角。開動層流凈化裝能污染的死角。開動層流凈化裝置，同時用紫外殺菌燈照射置，同時用紫外殺菌燈照射30min。 n2.1.2其他設(shè)備、凈化工作臺、恒溫其他設(shè)備、凈化工作臺、恒溫培養(yǎng)箱（培養(yǎng)箱（3035）、生化培養(yǎng)箱）、生化培養(yǎng)箱（2528），微波爐（或其他適），微波爐（或其他適宜加熱裝置）、康氏振蕩器、勻漿宜加熱裝置）、康氏振蕩器、勻漿儀（儀（30008000r/min）、）、恒溫恒溫水浴、電熱干燥箱（水浴、電熱干燥箱（250300）、）、電冰箱、空調(diào)、高壓蒸汽滅菌器電冰箱、空調(diào)、高壓蒸汽滅菌器（使用時要進行滅菌效果檢查并應(yīng)（使用時要進行滅菌效果檢查并應(yīng)定期請有關(guān)部門

12、檢定）。定期請有關(guān)部門檢定）。n2.2 儀器及器皿儀器及器皿n2 . 2 . 1 菌 落 計 數(shù) 器 、 顯 微 鏡菌 落 計 數(shù) 器 、 顯 微 鏡（1500X）、）、電子天平或藥物天平電子天平或藥物天平（感量（感量0.1g），），pH系列比色計。系列比色計。 n2.2.2 玻璃器皿玻璃器皿 錐形瓶錐形瓶(250300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干內(nèi)裝玻璃珠若干)、研缽（陶瓷制，、研缽（陶瓷制，直徑直徑1012cm）、）、培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿(9cm)、量筒量筒(100ml)、試管試管(18180mm)及及塞、吸管塞、吸管(1ml分度分度0.01，10ml分度分度0.1)、注射器、注射器(20或是或是30ml

13、)、注射針注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸(帶蓋帶蓋) 。n玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)吸管口上端距抗菌物質(zhì)吸管口上端距0.5cm處塞處塞入約入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，再用牛試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于皮紙包扎。玻璃器皿，均于160干熱滅菌干熱滅菌2h或高壓蒸汽或高壓蒸汽121滅菌滅菌30min，烘干備用。烘干備用。n2.3 用具用具n2.3.1 大、小橡皮乳頭（放于干凈大、小橡皮

14、乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。乙醇溶液浸泡）。n2.3.2 無菌衣、帽、口罩、手套無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴）滅（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴）滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。帽、口罩、手套。n2.3.3 接種環(huán)接種環(huán) (白銥金或鎳鉻合金，白銥金或鎳鉻合金， 環(huán)徑環(huán)徑45mm、長度長度610cm)、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹

15、鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、）、實實驗記錄紙等。驗記錄紙等。n3 試液試液 n3.1消毒液消毒液n3.1.1 0.1%苯扎溴銨溶液（供洗手、苯扎溴銨溶液（供洗手、擦拭操作臺面用）。擦拭操作臺面用）。n3.1.2 5%石碳酸溶液石碳酸溶液 (配好后裝入配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，玻璃消毒缸內(nèi)， 供消毒帶菌吸管用供消毒帶菌吸管用) 亦可選用其他適宜消毒液。亦可選用其他適宜消毒液。n3.1.3 75%乙醇溶液乙醇溶液n3.1.4 碘酊或碘伏溶液碘酊或碘伏溶液n3.2 稀釋劑和試劑稀釋劑和試劑n3.2.1 0.9%無菌

16、無菌n氯化鈉溶液氯化鈉溶液 (附錄附錄3.1)n3.2.2 無菌聚山梨酯無菌聚山梨酯-80n3.2.3 無菌聚山梨酯無菌聚山梨酯-80氯化鈉溶液氯化鈉溶液 (附錄附錄3.2)n3.2.4 無菌磷酸鹽緩沖液無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2) (附錄附錄3.3)n3.2.5 無菌無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶氯化三苯四氮唑溶液液(TTC) (附錄附錄2.15)n4 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 n4.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (附錄附錄5.2)n4.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 (附錄附錄5.3) n4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 (YPD) 瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基 (附錄附錄5.4)n

17、培養(yǎng)基制備應(yīng)注意：培養(yǎng)基制備應(yīng)注意：n4.3.1 采用干燥培養(yǎng)基，按說明配采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，應(yīng)對滅菌后的培養(yǎng)基制，應(yīng)對滅菌后的培養(yǎng)基pH值進行值進行校驗。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑校驗。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配制時瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)制時瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上的試劑。純以上的試劑。n4.3.2 配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。后使用。n4.3.3 培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的確的確2/3，以免滅

18、菌時溢出。包裝時，以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌。染菌。n4.3.4 培養(yǎng)基配置后應(yīng)在培養(yǎng)基配置后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，內(nèi)滅菌，避免細菌繁殖。避免細菌繁殖。n4.3.5 滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存?zhèn)溆?，放置時間不能過長，以免水備用，放置時間不能過長，以免水分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，開啟后不宜再用。一次用完，開啟后不宜再用。 n4.3.6 勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成份過度受熱而破壞。應(yīng)以免營養(yǎng)成份過度受熱而破壞。應(yīng)用水浴或微波爐加熱

19、。用水浴或微波爐加熱。n5 供試品抽樣、保存及檢驗量供試品抽樣、保存及檢驗量n5.1 抽樣抽樣 n5.1.1 一般采用隨機抽樣方法，抽一般采用隨機抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗用量（樣量應(yīng)為檢驗用量（2個以上最小包個以上最小包裝單位）的裝單位）的3倍量（以備復(fù)試）。倍量（以備復(fù)試）。n5.1.2 抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢沙闃訒r，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問的樣品，但的樣品，應(yīng)選取有疑問的樣品，但機械損傷機械損傷、明顯破裂的包裝不得作明顯破裂的包裝不得作為樣品。為樣品。 n5.1.3 凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、發(fā)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、

20、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需再抽樣檢驗。為不合格，無需再抽樣檢驗。n5.2 保存保存n5.2.1 供試品在檢驗之前，應(yīng)保存供試品在檢驗之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。引起致死，損傷或繁殖。n5.2.2 供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟。包裝已開啟包裝狀態(tài)，嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。的樣品不得作為供試品。n5.3 檢驗量檢驗量n5.3.1 所有劑型的檢驗量均需取所有劑型的檢驗

21、量均需取2個個以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，需取自需取自4丸、丸、4片以上）。片以上）。n5.3.2 固體及半固體固體及半固體(粘稠性供試品粘稠性供試品)制劑檢驗量為制劑檢驗量為10 g。n5.3.3 液體制劑檢驗量為液體制劑檢驗量為10 ml。n5.3.4 膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為劑檢驗量為3050cm2，化學(xué)藥及化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗量為生化藥膜劑檢驗量為10cm2。n5.3.5 特殊貴重或微量包裝的藥品，特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗量可酌減。除另有規(guī)定外，口檢驗量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于服固體制劑不低于3g

22、。液體制劑采液體制劑采用原液者不得少于用原液者不得少于6ml，采用供試采用供試液者不得少液者不得少3ml，外用藥品不得少外用藥品不得少5g。 n6 操作方法操作方法n6.1 試驗前準備試驗前準備n6.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、10ml）、）、量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入操作間。編號后夠用量，避免操作中出入操作間。編號后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。將全部外包裝（牛皮紙）去掉。

23、n6.1.2 開啟無菌室紫外殺菌燈和空開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作不低于氣過濾裝置，并使其工作不低于30min。 n6.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋。再用鞋。再用0.1%苯扎溴銨溶液或其苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。戴無菌衣、帽、口罩、手套。n6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口

24、處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封?；蚣魧⒐┰嚻穯⒎狻6.2 供試液的制備供試液的制備n6.2.1 液體供試品液體供試品 取供試品取供試品10ml，置滅菌錐形瓶中，加入置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，稀釋劑，搖勻，作為搖勻，作為1:10供試液。供試液。n含王漿或蜂蜜的液體制劑和滴眼劑含王漿或蜂蜜的液體制劑和滴眼劑直接用供試品作為供試液。直接用供試品作為供試液。n6.2.2 固體、半固體或粘稠供試品固體、半固體或粘稠供試品 稱取供試品稱取供試品10g，置于勻漿杯或適當置于勻漿杯或適當滅菌容器中，加入滅菌容器中，加入100ml 0.9%無菌無菌氯化鈉溶液

25、，用勻漿儀氯化鈉溶液，用勻漿儀（30005000r/，24min），），振蕩器或乳缽振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。胃溶膠囊加研磨等方法分散混勻。胃溶膠囊加稀釋劑后置稀釋劑后置451水浴中振搖，腸水浴中振搖，腸溶膠囊加無菌磷酸鹽緩沖液后先打溶膠囊加無菌磷酸鹽緩沖液后先打碎再置碎再置451水浴振搖溶解。水浴振搖溶解。n6.2.3 非水溶性供試品非水溶性供試品 軟膏劑、軟膏劑、乳膏劑乳膏劑 稱供試品稱供試品5g（5ml），），加入加入含已滅菌溶化并保溫含已滅菌溶化并保溫45左右的司左右的司盤盤-80 5g、單硬脂酸甘油酯單硬脂酸甘油酯3g、聚聚山梨酯山梨酯-80 10g混合物的燒杯中，混合物的燒杯

26、中，用無菌玻棒攪拌均勻后，慢慢加入用無菌玻棒攪拌均勻后，慢慢加入45左右的左右的0.9%無菌氯化鈉溶液無菌氯化鈉溶液85ml，邊加邊攪拌，使供試品充分邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（乳化，作為供試液（1：20）。）。 n油劑油劑 取供試品取供試品10ml，加入無菌聚加入無菌聚山梨酯山梨酯-80 58ml，搖勻，再加入搖勻，再加入稀釋劑至稀釋劑至100ml。n栓劑栓劑 稱取供試品稱取供試品10g，置滅菌錐形置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置瓶中，加適量稀釋劑，置45水浴水浴保溫保溫10min，使溶，加入無菌聚山使溶，加入無菌聚山梨酯梨酯-80 58ml，振搖使之乳化，振搖使之乳化，再加稀

27、釋劑（稀釋劑和聚山梨酯再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯-80總量為總量為100ml），搖勻。搖勻。n6.2.4 氣霧劑氣霧劑 將供試品置冰箱（將供試品置冰箱（4）h，取出，用碘伏棉球（也取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品開啟部可用乙醇棉球）擦拭供試品開啟部位周圍，然后以無菌鋼錐仔細鉆孔位周圍，然后以無菌鋼錐仔細鉆孔并插入容器中，勿移出鋼錐，以轉(zhuǎn)并插入容器中，勿移出鋼錐，以轉(zhuǎn)動方式使容器內(nèi)拋射劑全部拋出。動方式使容器內(nèi)拋射劑全部拋出。n以無菌注射器吸出全部藥液，按標以無菌注射器吸出全部藥液，按標示量補加稀釋劑至足量（若含非水示量補加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯溶性成份

28、，加適量無菌聚山梨酯-80液）此液即為供試品原液。液）此液即為供試品原液。 n6.2.5 膜劑膜劑 中藥膜劑一般取中藥膜劑一般取3050cm2， 將藥膜剪成碎片，置滅菌將藥膜剪成碎片，置滅菌錐形瓶中，錐形瓶中， 加入稀釋劑加入稀釋劑100ml， 于于451水浴保溫，振搖使溶。水浴保溫，振搖使溶。n西藥藥膜一般取樣為西藥藥膜一般取樣為10cm2，制備制備供試液方法同上。供試液方法同上。n6.2.6 茶劑茶劑 取供試品取供試品10g， 置滅菌置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑錐形瓶中，加入稀釋劑100 ml，振振搖搖30s，以滅菌紗布過濾（如為袋以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取泡茶，可直接取2袋，以稱

29、樣結(jié)果袋，以稱樣結(jié)果按按1：10加稀釋劑，浸泡加稀釋劑，浸泡30min）。）。n以上供試品如吸水膨脹，或粘度過以上供試品如吸水膨脹，或粘度過高，增加稀釋劑，制成都是高，增加稀釋劑，制成都是1：201：100供試液。供試液。n6.3 供試液的稀釋（供試液的稀釋（10倍遞增稀釋倍遞增稀釋法）法）n6.3.1 取取23支滅菌試管，分別加入支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑（此時操作一般為：滅菌稀釋劑（此時操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí)執(zhí)10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇燈吸管吸量，注意：勿在乙醇燈焰峰正上方操作，以免燈焰將供試液焰峰正上方操作，以免燈焰

30、將供試液中菌細胞殺滅）。加完稀釋劑后，試中菌細胞殺滅）。加完稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。管塞應(yīng)立即塞上。 n6.3.2 另取另取1支支1ml滅菌吸管吸滅菌吸管吸1：10均勻供試液均勻供試液1ml，加入裝有加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中混勻，即為滅菌稀釋劑的試管中混勻，即為1：100供試液。以此類推，根據(jù)供試供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至品污染程度，可稀釋至1：102、1：103、1：104等適宜稀釋級（至少等適宜稀釋級（至少共共3級）。每遞增級）。每遞增1稀釋級，必須另稀釋級，必須另換一支吸管。換一支吸管。n在作在作10倍遞增稀釋時，倍遞增稀釋時， 吸管插入第吸管插入第1級稀

31、釋液內(nèi)不低于液面級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm， 反復(fù)反復(fù)吸吹約吸吹約10次。吸液時，應(yīng)先吸至高次。吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，于吸管上部刻度少許， 然后提起吸然后提起吸管，管， 貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度， 再沿第再沿第2級稀釋管的內(nèi)壁靠近液面級稀釋管的內(nèi)壁靠近液面(勿接觸液面勿接觸液面)緩慢地吹出全部供試液緩慢地吹出全部供試液(吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體)，然后，然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。將吸管放入消毒液缸內(nèi)。 n6.4 注平皿注平皿 在進行在進行10倍遞增稀釋的同倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各級稀釋時，以該稀釋級吸管，

32、吸取各級稀釋液各液各1ml至每個滅菌平皿中（從高稀至每個滅菌平皿中（從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸支吸管），每一稀釋級注管），每一稀釋級注23個平皿（此個平皿（此時，一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，時，一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將右手執(zhí)吸管），注平皿時，將1ml供供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。留液體，防止反流到吸管尖端部。n同時作陰性對照（待各級稀釋液注同時作陰性對照（待各級稀釋液注皿完畢后，用皿完畢后，用1支支1ml吸管吸取稀釋吸管吸取稀釋劑各劑各1ml，分別注入分別注入4個

33、平皿中。其個平皿中。其中中2個作細菌陰性對照；另二個作霉個作細菌陰性對照；另二個作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另用菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，則再增瓊脂測定酵母菌數(shù)時，則再增加加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。n6.5 傾注培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)基 將預(yù)先配制好的培將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、養(yǎng)基（細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅納瓊脂，酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅納瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）熔化，冷至瓊脂）熔化，冷至45時，傾注上時，傾注上述各個平皿述各個平皿15ml，以順時針

34、或反時以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混勻，注意，針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混勻，注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上，置操作臺上待凝。蓋上，置操作臺上待凝。n6.6 培養(yǎng)培養(yǎng) 細菌計數(shù)平板倒置于細菌計數(shù)平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。霉菌、酵母霉菌、酵母菌計數(shù)平板于菌計數(shù)平板于2528培養(yǎng)箱中培培養(yǎng)箱中培養(yǎng)養(yǎng)72h。n6.7 菌落計數(shù)菌落計數(shù)n6.7.1 一般將平板置菌落計數(shù)器上或一般將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點計，以透從平板的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)

35、和平皿邊緣生長的計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。挑取可疑物涂片鏡檢。 n6.7.2 供試品如為微生物制劑，應(yīng)供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點計將有效微生物菌落排除，不可點計在細菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除在細菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察

36、菌落特征及染色形態(tài)。并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。n6.7.3 供試品稀釋液常含有不溶性原供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后可能產(chǎn)生沉料、輔料，培養(yǎng)基注皿后可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落肉眼相鑒別的有形物。為且難與菌落肉眼相鑒別的有形物。為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿（宜稀釋級的供試液多增加注皿（12個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作為對照。為對照。n或用或用0.001%TT

37、C營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物區(qū)別開來。區(qū)別開來。n有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認和點計，為防止長的菌落不易辨認和點計，為防止這種情況，也可用這種情況，也可用0.001%TTC營養(yǎng)營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長的菌落為瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點計。紅色，襯于白色背景上易于點計。n6.7.4 若平板上有若平板上有2 個或個或2個以上菌個以上菌落重疊，肉眼可辨別時仍以落重疊，肉眼可辨別時仍以2個或個或2個

38、以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界限，一條狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延的較大仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延的較大片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數(shù)用。作為計數(shù)用。n6.7.5 計錄各稀釋級平板的菌落數(shù)，求計錄各稀釋級平板的菌落數(shù)，求出各稀釋級出各稀釋級2或或3個平板菌落的平均數(shù)。個平板菌落的平均數(shù)。當菌落數(shù)在當菌落數(shù)在15以上的同稀釋級二平板以上的同稀釋級二平板菌落數(shù)相差菌

39、落數(shù)相差1倍時，該稀釋級菌落數(shù)不倍時，該稀釋級菌落數(shù)不得作為計數(shù)依據(jù)；當?shù)米鳛橛嫈?shù)依據(jù)；當2個平板菌落數(shù)均個平板菌落數(shù)均在在15（含（含15）以下時，兩個平板菌落）以下時，兩個平板菌落數(shù)的差值允許范圍為數(shù)的差值允許范圍為04，17，2-9，310，412，514，615。超出。超出以上范圍即視為操作誤差，不得作為以上范圍即視為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。計數(shù)依據(jù)。n6.7.6 在下列情況下、點計菌落時間在下列情況下、點計菌落時間需提前或延長培養(yǎng)時間：需提前或延長培養(yǎng)時間： n6.7.6.1 菌落生長呈蔓延趨勢者，細菌落生長呈蔓延趨勢者，細菌點計需在菌點計需在24h，霉菌點計需在霉菌點計需在48

40、h作初步點計（點計霉菌菌落時，動作初步點計（點計霉菌菌落時，動作宜輕，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板或造成震作宜輕，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板或造成震動，使早期形成的孢子散落在平板動，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計數(shù)誤差）。導(dǎo)致計數(shù)誤差）。n6.7.6.2 在在48h點計細菌，點計細菌，72h點計點計霉菌時，菌落極小不易辨認，需延霉菌時，菌落極小不易辨認，需延長培養(yǎng)時間長培養(yǎng)時間47天，再點計菌落數(shù)。天，再點計菌落數(shù)。n6.7.6.3 對有疑議的供試品以對有疑議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至1周再點計菌落數(shù)。周

41、再點計菌落數(shù)。n6.7.7 供試品按營養(yǎng)瓊脂平板點計供試品按營養(yǎng)瓊脂平板點計細菌菌落數(shù)；固體供試品按玫瑰紅細菌菌落數(shù)；固體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂平板點計霉菌數(shù)，一般液體鈉瓊脂平板點計霉菌數(shù)，一般液體供試品按玫瑰紅鈉平板點計霉菌及供試品按玫瑰紅鈉平板點計霉菌及酵母菌總數(shù)；含蜂蜜及王漿的合劑酵母菌總數(shù)；含蜂蜜及王漿的合劑按玫瑰紅鈉瓊脂平板點計霉菌菌落按玫瑰紅鈉瓊脂平板點計霉菌菌落數(shù)，按數(shù)，按YPD瓊脂平板點計酵菌落數(shù)，瓊脂平板點計酵菌落數(shù)，二者合并為霉菌及酵母菌數(shù)。二者合并為霉菌及酵母菌數(shù)。n6.8 菌落數(shù)報告規(guī)則菌落數(shù)報告規(guī)則:n6.8.1 細菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在細菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30300之

42、間的稀釋級，霉菌、酵母菌數(shù)之間的稀釋級，霉菌、酵母菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀之間的稀釋級作為報告菌數(shù)的依據(jù)。釋級作為報告菌數(shù)的依據(jù)。n如只有如只有1個稀釋級平均菌落數(shù)在此個稀釋級平均菌落數(shù)在此30300（30100）之間，則將該?。┲g，則將該稀釋級的菌落計數(shù)器乘以稀釋倍數(shù)報告釋級的菌落計數(shù)器乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表例（見附表例6.8.1）。）。 n6.8.2 如有如有2個相鄰稀釋級平均菌落個相鄰稀釋級平均菌落數(shù)在數(shù)在30300（30100）時，則按）時，則按比值計算。當比值比值計算。當比值2時，則以時，則以2個個稀釋級的平均菌落數(shù)均值報告。當稀釋級的平均菌落數(shù)均值

43、報告。當比值比值2時，則以低稀釋級的平均時，則以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表附附6.8.3）。）。 比值比值= 高稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)高稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù) 低稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)低稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù) n6.8.3 如有如有3個稀釋級平均菌落數(shù)均個稀釋級平均菌落數(shù)均在在30300 (30100)之間時，則以后之間時，則以后2個稀釋級計算級間比值報告?zhèn)€稀釋級計算級間比值報告(同同6.8.2)，(見附表例見附表例6.8.3)。n6.8.4 如各稀釋級平均菌落數(shù)均在如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級）以上，則按

44、最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在各稀釋級平均菌落數(shù)均在30以下，以下，則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表釋倍數(shù)報告（見附表6.8.4）。）。n6.8.5 如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30300 (30100)之間，則以最接近之間，則以最接近30或或300（100）的稀釋級平均菌落數(shù)的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表6.8.5）。n6.8.6 如各稀釋級的平均菌落數(shù)均無如各稀釋級的平均菌落數(shù)均無菌落生長或最低稀釋級平均菌落數(shù)菌落生長或最低

45、稀釋級平均菌落數(shù)小小于于1時，應(yīng)報告菌落數(shù)為時，應(yīng)報告菌落數(shù)為10個個/g或或ml（見附表例見附表例6.8.6）。如供試品原液）。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，報告未平板均未生長霉菌及酵母菌，報告未檢出霉菌及酵母菌檢出霉菌及酵母菌/ml。n6.8.7 當各稀釋級平均菌落數(shù)小于當各稀釋級平均菌落數(shù)小于30時，如高稀釋級平均菌落大于或時，如高稀釋級平均菌落大于或等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應(yīng)以等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法重新測定，按測定結(jié)培養(yǎng)基稀釋法重新測定，按測定結(jié)果報告菌落數(shù)（見附表例果報告菌落數(shù)（見附表例6.8.7）。）。 n培養(yǎng)基稀釋法測定培養(yǎng)基稀釋法測定n培養(yǎng)基稀釋法

46、：培養(yǎng)基稀釋法：n取低稀釋級供試液（原液或取低稀釋級供試液（原液或1：10供試液）供試液）3份，每份各份，每份各1ml，分別注分別注入入5個或個或5個以上平皿中（每皿個以上平皿中（每皿0.2ml或或0.2ml），），每每1個平皿傾個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。n5個或個或5個以上平板點計的菌落之個以上平板點計的菌落之和，即為每和，即為每1ml菌落計數(shù)器，共得菌落計數(shù)器，共得3 組數(shù)據(jù)。以組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級供試液份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。告。n6.9 結(jié)果報告

47、結(jié)果報告n6.9.1 菌落數(shù)在菌落數(shù)在100以內(nèi)時，以內(nèi)時， 按實按實有數(shù)據(jù)報告。有數(shù)據(jù)報告。n6.9.2 菌落數(shù)大于菌落數(shù)大于100時，取兩位有時，取兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)字修約規(guī)效數(shù)字報告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。則處理。n6.10 復(fù)試復(fù)試 供試品細菌數(shù)、霉菌及供試品細菌數(shù)、霉菌及酵母數(shù)其中任一項一次檢驗不合格，酵母數(shù)其中任一項一次檢驗不合格，應(yīng)重新取應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法倍包裝量供試品，依法作單項復(fù)試兩份，以三次檢驗結(jié)果作單項復(fù)試兩份，以三次檢驗結(jié)果的均值報告。的均值報告。n7注意事項注意事項n7.1 供試品檢驗全過程必須符合無供試品檢驗全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用

48、滅菌作具時，不菌技術(shù)要求。使用滅菌作具時，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。吸管不得用口吹吸。n7.2 從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在基操作應(yīng)在1h內(nèi)完成，避免由于時內(nèi)完成，避免由于時間過長導(dǎo)致菌細胞繁殖或死亡。間過長導(dǎo)致菌細胞繁殖或死亡。n7.3 供試液稀釋及注皿時應(yīng)取均勻的供試液稀釋及注皿時應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實驗誤差。供試液，以免造成實驗誤差。n7.4 為避免細菌菌落蔓延生長，宜采為避免細菌菌落蔓延生長，宜采用下列方法處理：用下列方法處理：n7.4.1 開蓋干燥開蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板將已凝固的瓊脂平

49、板開蓋，倒置斜放于凈化工作臺上，開開蓋，倒置斜放于凈化工作臺上，開機機12h后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；n7.4.2 換陶瓦蓋換陶瓦蓋 將已凝固的瓊脂平將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。n7.4.3 加加TTC 于傾注培養(yǎng)基前，在于傾注培養(yǎng)基前，在每每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1% TTC溶液溶液1ml（最終濃度為最終濃度為0.001%），），混勻后傾注平皿?；靹蚝髢A注平皿。 n7.5 一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)細菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂平板計數(shù)霉數(shù)細菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂平板計數(shù)霉菌、酵

50、母菌數(shù)。在特殊情況下，如營菌、酵母菌數(shù)。在特殊情況下，如營養(yǎng)瓊脂平板生長了霉菌、酵母菌，且養(yǎng)瓊脂平板生長了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的霉菌和酵母多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，則營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、菌菌落數(shù)，則營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌數(shù)報告；反之，如玫瑰紅鈉瓊酵母菌數(shù)報告；反之，如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細菌，且多于營養(yǎng)瓊脂脂平板生長了細菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的細菌菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊平板的細菌菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細菌數(shù)報告。脂平板的細菌數(shù)報告。n如營養(yǎng)瓊脂平板生長的霉菌、酵母如營養(yǎng)瓊脂平板生長的霉菌、酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂平板生長的細菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂平板生長

51、的細菌菌落數(shù)超過該品種微生物限度規(guī)菌菌落數(shù)超過該品種微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試定時，經(jīng)復(fù)試2次，如次，如3次結(jié)果的平次結(jié)果的平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判供試品不合均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。格。n8 檢驗報告書檢驗報告書n本品按中國藥典本品按中國藥典2000年版微生物年版微生物限度檢查法標準檢驗，結(jié)果符合限度檢查法標準檢驗，結(jié)果符合或不符合規(guī)定。或不符合規(guī)定。 二、大腸桿菌檢查法二、大腸桿菌檢查法n1簡述簡述n大 腸 桿 菌 即 大 腸 埃 希 菌大 腸 桿 菌 即 大 腸 埃 希 菌（Escherichia coli），），為腸桿菌科為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大埃希菌屬的模式種。埃

52、希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等四個種。希菌等四個種。n大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。的棲居菌，隨糞便排出體外。n在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。品必須

53、檢查大腸桿菌。n 用用 4 - 甲 基 傘 形 酮 葡 糖 苷 酸 （甲 基 傘 形 酮 葡 糖 苷 酸 （ 4 -Methylumbelliferyl-D-glucuronide，即即MUG）和靛基質(zhì)和靛基質(zhì)（Indole）試驗檢查試驗檢查大腸桿菌是一項新技術(shù)，其檢驗步驟為：大腸桿菌是一項新技術(shù)，其檢驗步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個菌，如個菌，如MUG、Indole試驗為陽性或陰試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果，如性即可報告結(jié)果，如MUG與與Indole試驗試驗不一致時，則需分離

54、培養(yǎng)、革蘭染色、鏡不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。檢及生化試驗鑒別。n原理原理:利用目標菌限定酶作用的底利用目標菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來鑒定目標菌。應(yīng)作為指示系統(tǒng)來鑒定目標菌。n實驗證明實驗證明96% 的大腸桿菌含的大腸桿菌含-葡糖葡糖苷酸酶（苷酸酶（-glucuronidase，GUD），），約約10% 的沙門氏菌屬一些菌種也含的沙門氏菌屬一些菌種也含有此酶。有此酶。nMUG被被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強行千萬倍，易于觀察，沒有

55、主觀性，行千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。的檢測。n 單一的單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏鑒別大腸桿菌其漏檢率達檢率達6%，鑒于，鑒于98%的大腸桿菌的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG-靛靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板瓊脂平板分離，輔分離，輔以以IMViC試驗，在理論上試驗，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達可使大腸桿菌的檢出率達99%。 n三、沙門菌檢查法三、沙門菌檢查法n1. 簡述簡述n沙門氏菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，沙門氏菌屬

56、是腸桿菌科的重要致病菌，沙門菌分沙門菌分5個亞屬，包括常見的傷寒、個亞屬，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌在內(nèi)，寒、鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌在內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)迄今已發(fā)現(xiàn)2000多個菌型。多個菌型。n藥品中沙門菌，是以鑒定沙門菌屬藥品中沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準，即對每為準，即對每g（或或ml）藥品中是藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗報告。否檢出沙門菌作出檢驗報告。n由于沙門菌菌型繁多，各菌型的生由于沙門菌菌型繁多，各菌型的生化及血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不化及血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌增培養(yǎng)基和盡相同，采用一

57、種增菌增培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能是所有沙兩種分離培養(yǎng)基，不可能是所有沙門菌的最適增菌及分離條件。門菌的最適增菌及分離條件。n此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進行預(yù)增。然后再進行增菌及分離、進行預(yù)增。然后再進行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、血清學(xué)試驗等步驟血清學(xué)試驗等步驟 。四、銅綠假單胞菌檢查法n1簡述簡述n銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌（P

58、seudomonas aeruginosa），），習(xí)稱綠膿桿菌，為習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。n 本菌是常見的化膿性感染菌、在燒本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其他外科疾患中傷、燙傷，眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度、國內(nèi)外藥典均將銅了治療的難度、國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。n 銅綠假單胞菌按增菌，分離、純銅綠假單胞菌按增菌，分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢及生化試驗等培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。步驟進行檢驗。 五、金黃色葡萄球菌檢查法n1 簡述簡述n金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分為葡