實(shí)時(shí)熒光Taqman探針設(shè)計(jì)

1、一、實(shí)時(shí)熒光 Taqman 探針設(shè)計(jì) 總原則：探針選擇要保守，引物選擇要保守，因此必須找一段 100-200bp 相對(duì)要保守的片 段來設(shè)計(jì)引物與探針。即real-time PCR的擴(kuò)增片段是 50bp-150bp。當(dāng)找不到150bp的保守片段時(shí)，必須確保探針的片段是保守的。在設(shè)計(jì)探針和引物時(shí)， 要同時(shí)考慮在兩條鏈上設(shè)計(jì)引物與探針。 但要注意的是：在那條鏈上 設(shè)計(jì)探針時(shí)，就應(yīng)靠近在同一條鏈上設(shè)計(jì)的引物 （即上游引物 ）。這樣，可保證在將來擴(kuò)增時(shí)， 即便沒有完全擴(kuò)增，也有熒光信號(hào)報(bào)告出來。 兩者的距離最好是探針的5'端離上游引物的 3'有一個(gè)堿基，但也可以重疊。若在原序列中找不到合

2、適的探針與引物 （1 主要是探針和上游引物的距離太遠(yuǎn)，而離下游引 物的距離卻較近時(shí)； 2 突變位點(diǎn)要求在探針的 5'端也能檢測(cè)到熒光信號(hào)，但卻是在3'端），可在互補(bǔ)的序列中設(shè)計(jì)引物與探針。另real-time PCR中的探針和引物的 Tm值，均要高于平常 PCR的引物和雜交的探針的 Tm 值。二、探針的設(shè)計(jì) 探針設(shè)計(jì)的基本原則：1保守：探針要絕對(duì)的保守，有時(shí)分型就單獨(dú)依靠探針來決定。 理論上有一個(gè)堿基不配對(duì)， 就可能檢測(cè)不出來。若找不到完全保守的片段， 也只能選取有一個(gè)堿基不同的片段。 且這個(gè) 不同的堿基最好在探針的中間， 對(duì)探針與目的片段的雜交影響不大， 不相同的堿基最好不要

3、 在兩端，因?yàn)閮啥瞬焕谔结樀碾s交。且最好為A或T,而不能為G或A,因?yàn)锳、T為雙鍵，而G、A為三鍵。2探針長(zhǎng)度Taqman探針的長(zhǎng)度最好在 25-32bp之間，且Tm值在68-72 C之間，最好為70 C,確保探 針的Tm值要比引物的Tm值高出10C,這樣可保證探針在煺火時(shí)先于引物與目的片段結(jié) 合。因此探針最好是富含 GC的保守片段，保證其的Tm值較高。現(xiàn)在有Taqman MGB探針， 在TAMER之后再標(biāo)記一個(gè)MGB,可使探針的 Tm值較高,即使探針片段較短，也可達(dá)到Taqman探針的Tm值要求（68-70 C）。3探針的名稱 應(yīng)標(biāo)記探針在基因組的位置及長(zhǎng)度。4探針 Tm 值計(jì)算用olig

4、o或primer preiemer軟件即可計(jì)算 Tm值。確保探針中 GC含量在30-80%。應(yīng)避免 探針中多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基出現(xiàn)。5探針的評(píng)價(jià)用 DNAstar 軟件中的 Primerselect 軟件，點(diǎn)擊 “l(fā)og菜單中的 “create primer catalog ”，在“ name中輸入探針的名稱、位置，按Tab鍵進(jìn)入“ sequenee,粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個(gè)序列后， 在"report菜單下“primer self dimer分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個(gè) dimer ,并對(duì)此探針用 dG 值進(jìn)行評(píng)價(jià)

5、（通常給出最差的 dG 值,理 論上是dG值越大越好）。在"report菜單下“primer hairpins "分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的 窗口中就告訴此探針有多少個(gè)hairpins，并對(duì)此探針的hairpins進(jìn)行評(píng)價(jià)。多重?zé)晒釶CR時(shí)，要對(duì)多條探針進(jìn)行 "pair dimer 進(jìn)行分析。6.探針的5端不能為G,因?yàn)榧词箚蝹€(gè) G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G可以淬滅FAM 基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào),從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。7 Taqman 探針與引物之間的位置Taqman 探針應(yīng)靠近上游引物,即 Taqman 探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者 的距離最

6、好是探針的 5'端離上游引物的 3'有一個(gè)堿基，但也可以重疊，要保證 Taqman 探針 的 5'端離上游引物的 5'端至少有 4bp。如：forward primer Taqman probe5 J 3 '5 ' HF3 染料NNNNNNN NNNNNNN發(fā)表序列：5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'互補(bǔ)發(fā)表序列 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 5'NNNNNNN3 ' 5 'reverse primer或

7、：reverse primer5 J 3'NNNNNNN發(fā)表序列：5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'互補(bǔ)發(fā)表序列 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 5' NNNNNNN NNNNNNN料染 3' MAF5' 3 ' 5'Taqman probe forward primerTaqman probe forward primer三引物的設(shè)計(jì)1上下游引物要保守為了能夠擴(kuò)增出所需要的保守片段，必須對(duì)保守的 100-200 片段進(jìn)行 PCR

8、 擴(kuò)增。所以引物 的選取也要非常的保守， 最好不要有不同的堿基， 若不得不有時(shí)，也必須保證引物的 3'端至 少有 4 個(gè)堿基是完全保守才可。在設(shè)計(jì)保守引物時(shí)，要在發(fā)表序列上分別找保守一致的區(qū)域， 即在發(fā)表序列的 5'端引物位置 找的是 3'端至少有 5 個(gè) bp 保守，在即在發(fā)表序列的 3'端引物位置找的是 5'端至少有 5 個(gè) bp 保守。5' NNNNNNN 3'發(fā)表序列： 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'3' NNNNNNNNN 5 2上下游引物的長(zhǎng)度和 Tm

9、值上下游引物的長(zhǎng)度一般為 18-25bp之間，且Tm值在58-60 C之間。確保引物中 GC含量在 30-80% 。應(yīng)避免引物中多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)， 尤其是要避免 4個(gè)或超過 4 個(gè)的 G 堿基出現(xiàn)。 引物的3'端最好不為G或/和C。引物3端的5個(gè)堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個(gè)G或/和C。上游引物應(yīng)標(biāo)記 F（forword） ，且在基因組的位置及長(zhǎng)度；下游引物應(yīng)標(biāo)記 R（reverse） ，且在 基因組的位置及長(zhǎng)度。用 oligo 或 primer preiemer 軟件即可計(jì)算 Tm 值。上下游引物的 Tm 值相差最好不超過 2 C,長(zhǎng)度相差最好不超過 4bp。3引物的評(píng)價(jià)用 DNAstar 軟件

10、中的 Primerselect 軟件，點(diǎn)擊 “l(fā)og菜單中的 “create primer catalog ”，在“ name中輸入引物的名稱、位置，按Tab鍵進(jìn)入“ sequenee,粘貼或輸入要分析的引物序列。選中整個(gè)序列后， 在"report菜單下“primer self dimer分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個(gè) dimer ,并對(duì)此引物用 dG 值進(jìn)行評(píng)價(jià) （通常給出最差的 dG 值,理 論上是dG值越大越好）。在"report菜單下“primer hairpins "分析引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的 窗口中就告訴此引物有多少個(gè) hairpi

11、ns ,并對(duì)此引物的 hairpins 進(jìn)行評(píng)價(jià)。再選擇所需要的 上下游引物，在 "report菜單下“primer pair dimers分析上下游引物的 dimers。彈出的窗口 中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè) dimer ,并對(duì)此對(duì)引物用 dG 值進(jìn)行評(píng)價(jià) （通常給出最差的 dG 值, 理論上是 dG 值越大越好 （dG 值通常為負(fù)值 ）,絕對(duì)值超過 4.5kcal/mol 易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚 體帶,并且降低引物有效濃度而使 PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行 ）。不必考慮引物與探針之間的配 對(duì)與發(fā)夾結(jié)構(gòu),因?yàn)樘结樀?Tm 值非常之高。4上下游引物與探針的距離 （上下游引物的位置 ）理論上講，

12、上游引物的3'端離探針的5端為1-20bp，最佳是1bp，最近為上游引物的3端離探針的3'端為4bp ;下游引物要與探針有一定的距離，但要保證下游引物的 3'端離探針的3'端最為 15-150bp 。整個(gè)目的片段的長(zhǎng)度最好在 50-150bp 之間,最長(zhǎng)不超過 200bp 。 5簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)當(dāng)為了能夠同時(shí)擴(kuò)增即使在引物位點(diǎn)也有突變的目的片段,若多個(gè)堿基出現(xiàn)的概率相同,就要在此位點(diǎn),設(shè)計(jì)一個(gè)代表多個(gè)堿基的簡(jiǎn)并子。在合成引物時(shí),在合成到此位點(diǎn)時(shí),就不是 加入一個(gè)堿基,而是同時(shí)加入簡(jiǎn)并子所代表的多個(gè)堿基。這樣,實(shí)質(zhì)合成的引物是多條引物,只不過是在簡(jiǎn)并子位置堿基不同而

13、已。 但簡(jiǎn)并引物要考慮每條引物的 Tm 值,確保簡(jiǎn)并子所 代表的不同堿基的不同引物Tm值相差不超過2C。若超過2 C,在確保引物的3'端引物相同時(shí),在 Tm 值較低的堿基引物的 5'端加入幾個(gè)堿基,使其的 Tm 值相同。但這時(shí)就不是簡(jiǎn) 并引物,而是分別合成長(zhǎng)度不同,簡(jiǎn)并子位點(diǎn)堿基不同,但 Tm 值相同的兩條引物,最后在 進(jìn)行等濃度的混合即可。5 J 3'NNNANNNNNNGNNN序列： 5'-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'RR四、 實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇：1 多重實(shí)時(shí)PCR的多種含意有兩種：一為選擇保

14、守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探 針，在檢測(cè)時(shí)可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。 另一種為選擇保守的引物， 擴(kuò)增不同長(zhǎng) 度的目的片段，反應(yīng)中加入 SYBRN 染料，最后根據(jù)不同目的片段的 Tm 值來判定不同的物 品。2 多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時(shí)為Taqman探針、或同時(shí)為MGB探針、或同時(shí)為 Beacon 探針。3MGB 探針的優(yōu)點(diǎn)：a. MGB 探針較短 （14-20bp） ，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。b. 短片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10 C,更容易達(dá)到熒光探針 Tm值的要 求。4MGB 探針的設(shè)計(jì)原則1）探針的5端避免出現(xiàn)

15、G,即使探針?biāo)鉃閱蝹€(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的 G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。2）用primerexpress 軟件評(píng)價(jià) Tm值，Tm值應(yīng)為65-67 C。3）盡量縮短 Taqman MGB 探針，但探針長(zhǎng)度不少于 13bp 。4）盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn) 4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。5）原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)）。因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即Taqman MGB 不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡 量放在中間 1/3 的地方。

16、注意：為了滿足上述要求的 4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向 3'端移 動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離 3'端 2個(gè)堿基的前方 （即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是絕對(duì)的保守 ）， 以進(jìn)行 SNP 檢測(cè)。反過來，若要進(jìn)行同類檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個(gè)bp,探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的 5'端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì) 簡(jiǎn)并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測(cè)到突變。5. 在多重PCR中，多重PCR的各個(gè)引物之間相互干擾和各個(gè)探針之間相互干擾分析 設(shè)計(jì)好各對(duì)引物和探針后， 重新在用 DNAstar 軟件中的 Primerselect 軟件，打開保守在同一 文件中的多重 PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重引物或兩兩分別選中所設(shè) 計(jì)的多重探針后，在 "report菜單下“primer pair dimers分析上下游引物的 dimers。彈出的 窗口中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè) dimer ，并對(duì)此對(duì)引物用 dG 值進(jìn)行評(píng)