實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR原理和實(shí)驗(yàn)陳云地作者單位：200030美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems）無(wú)論是對(duì)遺傳?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀脱巡。魅静。ㄈ?肝炎和艾滋?。┗蚰[瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因 表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量 PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是 實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值， 從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的 DNA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。根據(jù)最終得

2、到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過不同方式 處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果 是百分比；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因 的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I熒光染料兩種方 法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù) 據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更 為簡(jiǎn)便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度 的要求來(lái)決定。定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要 求并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù) 實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi)對(duì)照

3、非常重要。由于各種各樣的客觀原因， 這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然， 與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量 PCR也要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以 監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問題。1為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確 ？我們都知道理論上 PCR是 一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但是 實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著 PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大， Taq酶、dNTR引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不 敷需求，PCR的效率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。 當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于 各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)

4、入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控 制。所以，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得 到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動(dòng)很大（圖 1）。圖1同一個(gè)樣本重復(fù)96次PCR的擴(kuò)增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后 的光密度掃描等，測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線 性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測(cè)等，需要測(cè)定的都是 PCR放大之前標(biāo)本中的 DNA原始拷 貝數(shù)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實(shí) 情況。在

5、這種情況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。2為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？CT 值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底 進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度的DNA作 PCR可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍， CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡(jiǎn)便， 以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以 在方程上增加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的

6、線性性質(zhì)。一般地，我們有 Rn=RB+X0(1+EX)nRS也就是說第n次PCR 循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)等于背景信號(hào)強(qiáng)度(RB)加上 每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS)與分子數(shù)目的 乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù) n = CT時(shí)，則有 RT=RB+X0(1+EX)CTRS 兩邊取對(duì)數(shù)，得 log(RT -RB) = logXO + CTIog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTIog(1+ Ex) = - logXO + Iog(RT -RB) -logRs。log Xolog( Rr - Ra) - log Rs7 log(l+)1喊1+£丿所以對(duì)于每一個(gè)特定的 PCR反

7、應(yīng)來(lái)說，EX RT RB和RS都 是常數(shù)，所以CT值與log X0成反比，也就是說，CT值與 起始模板拷貝數(shù)(X0)的對(duì)數(shù)成反比，起始DNA濃度每增加1 倍, CT值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的， 而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR的效率(即Ex)為100%從上式推算出定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和CT值的最佳范圍。3怎樣確定CT值？實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍。閾值所在的橫線與 PCR擴(kuò)增 曲

8、線的交點(diǎn)所指的 PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定 義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù) 每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個(gè)循環(huán)之間。 早于3個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)很弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個(gè)循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開始增強(qiáng)，超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來(lái)處理。Ct值圖2 CT值和閾值顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實(shí) 驗(yàn)的質(zhì)量，CT值是一個(gè)完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝 數(shù)越少。正常的 CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將

9、影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。4熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化雖然大多數(shù)定量 PCR儀都會(huì)自動(dòng)扣除本底，但是仍然 需要注意熒光信號(hào)強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不 同樣本之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā) 效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始 信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的 影響。這種校正可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染 料來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般采用紅色 ROX熒光，稱為陽(yáng)性參比信號(hào)。 ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因 和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽(yáng)性參比信號(hào)以后，

10、即Rn = R /RROX就可以在同樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種計(jì)算。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖 3）。rHiiifiwiiiiiiiiiii -au rr aai rju w| Iv aaa w am mt mb :*wiSSb'*7"；iJl 77TZ*ifLi= in ?! ria4m d- * lMVI; = =;=;_._ = =_;=:=E _ _ iw «« Kw* E M M L耆一 r + T -I M：1 «“-*« hi iiii ii hih 選:" 三豈二丘=.ZZ tZZ

11、=：二iZ <Z 二ZZ 三KS8s_i 圖3 ROX熒光校正（左）和不校正（右）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底，就得到DRn DRn = Rn,樣 本-Rn,空白。DRn是最后構(gòu)建PCR實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。無(wú)論絕對(duì)定量還是相對(duì)定量，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還 要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是 以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來(lái) 源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/卩L或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以 拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上 的比較。這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋?lái)完成。參比一般選用b-a

12、ctin、GAPDH rRNA基因等管家基因。由于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素 影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的 數(shù)量。校正方法為：DNA樣本/ DNAIPC,或者DCT= CT, 樣本-CT, IPC 。因?yàn)镃T值與起始DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反 比關(guān)系，可以證明，這兩種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng) 管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，所以這種對(duì)照稱為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(Internal Positive Control, IPC)。要進(jìn)行 IPC 歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測(cè)能力，最好是 4色。 否則，目標(biāo)基因

13、和參比基因只能分兩管作定量，就不成其 為“內(nèi)”標(biāo)了。5污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施有使用 UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和熱啟動(dòng)。UNG酶的作用原理是降解含有 dU的雙鏈或單鏈 DNA它在50°C激活，95°C滅活。由于商用 PCR試劑盒 均以dUTP取代dTTP,所以PCR產(chǎn)物都是含有 dU的DNA鏈 在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟，UNG酶即可將已 有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不 采取措施，在加入 PCR試劑的過程中

14、、正式 PCR開始前就 會(huì)完成少量PCR擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金 牌Taq酶經(jīng)過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒有 活性；只有經(jīng)過95 C 10 min的熱啟動(dòng)以后，封閉被解 除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊 的生成。6標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽(yáng)性對(duì)照定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù) 據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實(shí)驗(yàn) 的每個(gè)樣本至少要重復(fù) 3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù) 68次，以滿足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。如果作絕對(duì)定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在 5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo) 準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的 DNA羊本，可以自己制 備，也可以購(gòu)買商品

15、化的試劑盒。其 PCR反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與 未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時(shí)定量。陰性對(duì)照中不加模板 DNA而以水或緩沖液代替， 用于檢驗(yàn)是否存在 PCR污染。陽(yáng)性對(duì)照則用于檢驗(yàn) PCR式劑和 實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問題。如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了IPC,則IPC既可以用來(lái)校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽(yáng)性對(duì)照的作用。7 TaqMan探針技術(shù)原理TaqMan探針法是高度特異的定量 PCR技術(shù)，其核心是 利用Taq酶的3'一5外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生 熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào) 的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCF反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR 引物和一條探針。

16、探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位 點(diǎn)在兩條引物之間。探針的 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，女口 FAM VIC等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán)(Quencher, Q)，女口 TAMRA。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告 基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信 號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié) 合的探針，其3一 5外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷， 報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光 信號(hào)(圖4)。所以，每經(jīng)過一個(gè) PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和 目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過程。信號(hào)的強(qiáng)度 就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。圖4 TaqMan探針

17、的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制TaqMan探針根據(jù)其3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為 兩種：普通的 TaqMan探針和TaqManMGBf針。MGBf針的 淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng) 度。同時(shí)探針上還連接有 MGB (Minor Groove Binder) 修飾 基團(tuán)(圖5)，可以將探針的 Tm值提高10°C左右。因此 為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè) 計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率 大為提高。因?yàn)樵谀０宓?DNA堿基組成不理想的情況下， 短的探針比長(zhǎng)的更

18、容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明，TaqMan MGE探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。圖 5 TaqMan MGB探針8 SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBFGreen I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。 當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從 DNA雙鏈上釋放出 來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào) 強(qiáng)度代表了雙鏈 DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法 定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng) SYBR Green染 料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。 2、DNA變性時(shí)，SYBRGreen 染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并

19、形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料 與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量 PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。圖6 SYBR Green I熒光染料與 DNA雙鏈的結(jié)合SYBFGreen I熒光染料能與所有的 DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì) DNA 模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是 一種成本低廉的選擇。9定量PCR儀簡(jiǎn)介目前在國(guó)內(nèi)使用得比較多的熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀有美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (Applied Biosystems ，ABI)的7000、 5700、7900、770

20、0型和羅氏公司的 LightCycler 等。下面 以ABI最新推出的7000型為例作簡(jiǎn)單介紹。7000 型熒光定量PCR儀設(shè)計(jì)滿足臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件 Primer Express 非常 有用，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針。7000 型有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(PlateRead)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量，測(cè)定DNA或RNA拷貝數(shù)。7000型可以動(dòng)態(tài)顯示 PCR擴(kuò)增曲線的生成， 定量的線性范圍大于 7個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷 貝

21、的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒 定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性( SNP分析等。當(dāng)然， 7000型也可以作為普通 PCR儀使用。ABI已經(jīng)發(fā)布12萬(wàn)個(gè) 商品化的定量PCRM劑盒，覆蓋人類全部 4萬(wàn)個(gè)基因，平 均每個(gè)基因3個(gè)檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用 7000、7700、7900型 開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。7000 型最大特色是具備多色檢測(cè)能力，熒光檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍為530590 nm，能夠有效地分辨 FAMTM / SYBR? Green I、VICTM / JOETM、TAMRATI和 ROXTM等熒光染料。 多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)

22、對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一 反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精 度并節(jié)約成本。7000 型支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線 (Dissociation Curve)功能 用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. "Advances inquantitative PCR technology: 5nuclease assays."Curr Opin Biotechnol 9: 43-48.

23、1998.2 Orlando, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli."Developments in quantitative PCR." Clin ChemLab Med 36: 255-269. 1998.絕對(duì)定量3 Becker K., D. Pan and C.B. Whitley. 1999. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther. 10: 2559-2566, 1999.4 de Kok, J.B., Hendriks, J.C., van Solinge, W.W.,Willems, H丄.，Mensink, E.J., and Swinkels, D.W. Useof real-time quantitative PCRto compare DNAisolation methods. Clin.Chem. 44(10): 2201-2204, 1998.5 Wang X., X. Li, R.W. Currie, R.N. Willette, F.C.Barone and G.Z.