免疫組化方法和步驟

1、免疫組化檢測CD34+的表達1基本原理免疫組化，是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(im mun ohistochemistry)或免疫纟田胞化學技術(im muno cytochemistry)。威斯騰生物 400-675-6758(1 ) 1 X PBS ( pH 7.4 , 2.5L=20.0157g137mMNaCI+0.499552g2.68mMKCI+0.50013075g 1.47mM KH2PO

2、4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4) , 115 CX15 min ;(2) 0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 °CX15 min ;(3) 4%多聚甲醛500 ml=20 g 多聚甲醛+500 ml PBS 在65 C水箱中3 h多，再放入4 C保存。(4) DNase I buffer : 40 mM Tris-HCl ( pH 7.9 ) +10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10mM CaCl2 ;(5) Proteinase K buffer : 100 mM Tris-HCl ( pH 8.0 )

3、 +50 mM EDTA ;(6) DNase 1 (原液 1000 U/ml 按 1 : 99DNase 1 緩沖液稀釋至 10 U/ml );9)另外， 雙蒸水、 無菌 0.85%NaCl 、二甲苯、梯度乙醇 (100 、95 、85、70、50% )浙江紹興醫(yī)療器械總廠蘇州凈化設備公司美國 SHEL LAB 公司上海躍進醫(yī)療器械廠美國 Beckman 公司上海江蘇江陰科研器械廠德國 BM 公司德國 BM 公司德國美國上海醫(yī)用儀器廠日本日本日本(8) 20 jig/ml Proteinase K工作液(按 1 : 500 稀釋貯存液 1 mg/ml )。蘇木素。2 主要儀器設備電熱壓力蒸汽

4、消毒器 (XDD)超凈工作臺TC2323 型 CO2 恒溫孵箱恒溫烤箱高速臺式離心機 (BACKMAN CS-15R) 抽濾器 ( AUTOSCIENCE AP-01) 磁力攪拌器 (79-1)0.22um 纖維素濾膜0.45um 混合纖維素濾膜1/10000 電子天枰 (Sartorius AC-211)細胞培養(yǎng)瓶及細胞培養(yǎng)板 (Costar) 細胞計數(shù)板光學顯微鏡 (OLYMPUS CK-40) 倒置顯微鏡( OLYMPUS) 照像系統(tǒng) (OLYMPUS BH-2)展片機：德國 Leica ， HI1210 型烤片機：德國 Leica ， HI1220 型3 實驗方法3.1 載玻片的處理：

5、抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。1. APES ：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 APES 中，停留 2030 秒 鐘，取出稍停片刻， 再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的 APES ，置通風櫥中晾干即可。 用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。2. HistogripTM ：將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 Histogrip 液中， 停留 12 分 鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或 60oC 烤箱烘烤一小時，裝盒備用。3. Poly-L-Lysine ：將洗凈、 干燥的載

6、玻片放入以 1:10 比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液 中，浸泡 5 分鐘， 60oC 烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均 為非玻璃制品。3.2 常用酶消化：1 ）胰蛋白酶：一般使用濃度為 0.05%0.1% ，消化時間為37 C、1040分鐘，主要用于 細胞內(nèi)抗原的顯示。2）胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37 C、30180分鐘，主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示，如： Laminin （層粘蛋白） ， Collagen IV （ IV 型膠原）等。3 ）皂素（ Saponin ）：一般使用濃度為 210 g/ml 的 saponin 溶液，消化時間為室溫孵育3

7、0 分鐘。3.3 抗原熱修復可根據(jù)實驗室的具體條件， 選用微波爐抗原修復、 高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。 抗 原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（ pH6.0 ）效果最好。3.3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法： 切片脫蠟至水后， 3H2O2 處理 10 分鐘， 蒸餾水洗2分鐘X3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在 92 C98 C之間并持續(xù)1015分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用 微波爐，請根據(jù)具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，

8、室溫冷卻 1020 分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢 復原有的空間構型） 。 PBS 洗，下接免疫組化染色步驟。3.3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml3000ml 的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片 位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱56 分鐘后），計時 12 分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘X 3，下接免疫組化染色步驟。3.3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法： 切片脫蠟至水后， 放入盛有

9、枸櫞酸鹽緩沖液 （工從小作液） 的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，容器的溫度到達 92 C 98 C起開始計時1520分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻2030分鐘，蒸餾水沖洗， PBS 洗，下接免疫組化染色步驟。3.3 免疫組化染色步驟：1 、石蠟切片脫蠟， 100% 二甲苯 10minX 2,50% 二甲苯 5min 。2 、復水：無水乙醇 5minX 2；95% 乙醇 5min ；90% 乙醇 5min ；80% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ，蒸餾水洗滌 5min 。3、3%H2O2 室溫孵育 15 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。4、PB

10、S浸泡5分鐘X 3次5 、抗原修復：加入 0.2%Triton X-100 室溫下 4 分鐘，棄去液體， 0.5%Triton X-100 室溫下10分鐘，PBS沖洗，5分鐘X 3次。6、6正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 20 分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37 C孵育12小時或4 C過夜。7、PBS浸泡5分鐘X 3次。8、 滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37 C孵育30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37 C或室溫孵育30分鐘。9、PBS沖洗，5分鐘X 3次。10、滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋）,37 C孵育1030分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 C或室溫孵育103