試驗(yàn)室血清學(xué)常用檢測(cè)方法

1、常用血清學(xué)檢測(cè)方法介紹一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)目前，該項(xiàng)技術(shù)已在獸醫(yī)學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用， 大多數(shù)動(dòng)物傳染病都已經(jīng)研 制成ELISA檢測(cè)方法。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué) 活性，乂保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相 載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合 物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在 固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)

2、的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接 相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。2、ELISA的類型根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于動(dòng)物疫病檢測(cè)的 ELISA主要有以下幾種類型： .雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各 種蛋白質(zhì)、微生物病原體第二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如豬瘟病蠹檢測(cè)ELISA、禽流感病蠹抗原捕獲ELISA

3、,就是根據(jù)這種原理設(shè)計(jì)的。 .雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以 檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。乙肝HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的 不同，尋找合適的標(biāo)記方法。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于于間接 法。此外，該方法不受被檢動(dòng)物種屆差異的限制。 .間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗體(抗免疫球蛋白 抗體)，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體(見圖1)。操作步驟如下：(1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去

4、未結(jié)合的抗 原及雜質(zhì)。(2)加稀釋的受檢血活，保溫反應(yīng)。血活中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血活中的其他成份在洗滌過程中被洗去。山.(鏟澳漸哺酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo) 固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)，抗人IgG檢IgG抗彳從而間接地標(biāo)記上酶。洗源后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。(4)加照颯換包被抗原尸酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。本T如體的檢測(cè)而進(jìn)行傳:染病的診斷。間接法I皿點(diǎn)虎 "三宙或可其卅同嚀二申士/士盲 v 湖士才AS 1間接法額航體實(shí)照原理間接法在動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)中應(yīng)用廣泛

5、，例如禽流感的間接ELISA,用禽流感病蠹NP蛋白包被成抗原板，待檢血活中的抗體與之結(jié)合，再加酶標(biāo)二抗反應(yīng)， 可以檢測(cè)所有A型禽流感病蠹抗體。 .競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去， 或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此 法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)固相抗原。 標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺丁陰性 反應(yīng)。 .競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原共 同競(jìng)爭(zhēng)一定量的酶標(biāo)抗體。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體

6、愈 少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等 ELISA測(cè)定多用此法。例如，豬瘦肉精的檢測(cè)，多用瘦肉精抗原包被反應(yīng)板，讓樣品中的瘦肉精抗 原和板上的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)單克隆抗體。目前，已有商品化、標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒，可檢測(cè)豬瘟、豬偽狂犬、豬藍(lán)耳病、 豬乙型腦炎、豬細(xì)小病蠹、豬圓環(huán)病蠹、豬弓形蟲、豬喘氣病等各種抗體。（二）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)1、基本概念沉淀反應(yīng)：是利用可溶性抗原與抗體結(jié)合，形成肉眼可見的沉淀的一類血活 學(xué)免疫反應(yīng)。抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等。如細(xì)菌內(nèi)蠹素、外蠹素、菌 體裂解物，病蠹懸液、病蠹的可溶性抗原、血活、組織浸出液等。沉淀試驗(yàn)包括 絮狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

7、：是一種運(yùn)用沉淀反應(yīng)原理進(jìn)行獸醫(yī)診斷檢測(cè)的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn) 方法。2、基本原理瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是利用抗原抗體能在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，并在瓊脂中結(jié)合， 在一定比例處凝聚形成沉淀線，從而對(duì)抗原或抗體進(jìn)行的測(cè)定、比較、鑒定和檢 測(cè)。該方法具有簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)，不需使用大量昂貴儀器設(shè)備，易于操作而被廣 泛采用。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)分為四種類型：?jiǎn)蜗騿螖U(kuò)散、單向雙擴(kuò)散、雙向單擴(kuò)散、 雙向雙擴(kuò)散。其中應(yīng)用最廣的是雙向單擴(kuò)散和雙向雙擴(kuò)散， 雙向單擴(kuò)散主要用于 對(duì)抗原抗體的定量測(cè)定，雙向雙擴(kuò)散主要用于對(duì)抗原的比較， 以及抗原抗體的檢 測(cè)。雙向雙擴(kuò)散簡(jiǎn)稱雙擴(kuò)散，即抗原抗體在瓊脂中相互擴(kuò)散，各自產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)大 的環(huán)，兩環(huán)相遇時(shí)，在比

8、例適當(dāng)處，產(chǎn)生一條致密的白色沉淀線。這條沉淀線同 時(shí)能阻止相同的抗原、抗體成分的繼續(xù)擴(kuò)散。根據(jù)所用試劑及檢測(cè)對(duì)象的不同，雙擴(kuò)散乂分為兩類，一類利用已知抗原 檢測(cè)抗體，即血活流行病學(xué)調(diào)查，如禽流感、藍(lán)舌病、口蹄疫、牛白血病、馬傳 貧、非洲馬瘟、禽霍亂等，另一類是利用己知抗體檢測(cè)抗原，如馬立克羽髓抗原 的檢測(cè)。（三）凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)是顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）或表面載有抗原的顆粒狀物質(zhì) （如聚苯乙烯膠乳、紅細(xì)胞、碳素顆粒等），與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下，結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見的凝集(agglutination)現(xiàn)象的試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)是一個(gè)定性的檢測(cè)方法，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性 或陰性；也可以

9、進(jìn)行半定量檢測(cè)，即將標(biāo)本作一系列對(duì)倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為滴度。由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便，敏感度高，迄今已成為通用的免疫學(xué)試驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。間接凝集試驗(yàn)中的問接血凝試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛。1、直接凝集反應(yīng)細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體 結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)(direct agglutination) 0凝集反應(yīng)中的抗原稱 為凝集原(agglutinogen)，抗體稱為凝集素(agglutinin )。直接凝集試驗(yàn)可分為 玻片法、平板法、試管法及微量凝集法等。2、間接

10、凝集反應(yīng)將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng) (indirectagglutination)或被動(dòng)凝集反應(yīng)(passiveagglutination )。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可 溶性抗原的檢測(cè)，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。在間接凝集反應(yīng)中，可用作載體的顆粒種類很多，常用的有動(dòng)物或人紅細(xì)胞、 細(xì)菌和多種惰性顆粒如聚苯乙烯膠乳(polystyrenelatex)、活性炭、皂土 (bentonite)、脂質(zhì)體等，根據(jù)所用載體不同，間接凝集試驗(yàn)乂可稱為間接血凝試驗(yàn)、

11、膠乳凝集試驗(yàn)、炭凝集試驗(yàn)、皂土凝集試驗(yàn)、脂質(zhì)體凝集試驗(yàn)等。間接凝集反應(yīng)具有快速、敏感、操作簡(jiǎn)便、無需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備等特點(diǎn)，而 且能用于抗原或抗體的測(cè)定，因此在臨床檢驗(yàn)中廣為應(yīng)用。下面重點(diǎn)介紹最常用 的間接血凝試驗(yàn)和膠乳凝集試驗(yàn)。間接血凝試驗(yàn)以紅細(xì)胞作為可溶性抗原的載體來檢測(cè)抗體，稱為間接血凝試驗(yàn)( IHA ), 也稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)(PHA )。如將抗體吸附(致敏)在紅細(xì)胞上用于檢測(cè)抗原， 則成為反向間接血凝試驗(yàn)。該方法具有許多優(yōu)點(diǎn)：如敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)迅速，即可以定性乂可以半定量，而且試劑價(jià)格低廉，不需要特殊復(fù)雜 的儀器設(shè)備等。但是紅細(xì)胞凝集易受到如紅細(xì)胞的來源

12、，致敏條件和操作技術(shù)等 多種因素的影響，同時(shí)標(biāo)本中的雜質(zhì)、細(xì)菌污染和類屆抗原等乂常引起非特異性 凝集反應(yīng)，因此，試驗(yàn)時(shí)必須精心操作，注意防止污染，并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照。間接血凝試驗(yàn)在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛， 可用于口蹄疫、豬瘟以及弓形體病等 病的抗體的檢測(cè)。反向間接血凝試驗(yàn)還可應(yīng)用于口蹄疫病蠹的檢測(cè)和定型以及水 皰病病蠹抗原、豬傳染性胃腸炎病蠹抗原和小鵝瘟病蠹抗原等的檢測(cè)。膠乳凝集試驗(yàn)?zāi)z乳凝集試驗(yàn)也是一種間接凝集試驗(yàn)， 所用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳，是 一種直徑約為0.8 ni大小的圓形顆粒，帶有負(fù)電荷，可物理性吸附蛋白分子，但 這種結(jié)合牢固性差。也可制備成具有化學(xué)活性基團(tuán)的顆粒， 如帶有毯基的毯化聚 苯乙烯膠乳等,抗原或抗體以共價(jià)鍵交聯(lián)在膠乳表面?；瘜W(xué)交聯(lián)一般通過縮合劑 碳化二業(yè)胺將膠乳上的毯基與被交聯(lián)物上的氨基縮合在一起。這種用交聯(lián)致敏的膠乳試劑性能穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)。膠乳凝集試驗(yàn)分試管法與玻片法。試管法先將受檢標(biāo)本在試管中以緩沖液作 倍比稀釋，然后加入致敏的膠乳試劑，反應(yīng)后觀察膠乳凝集結(jié)果。