G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)驗(yàn)總結(jié)我做了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。有自己的體會(huì)也有其他戰(zhàn)友遇到的情況, 和大家分享. 沒有總結(jié)好的地方，大家補(bǔ)充。篩選之前確定G418濃度：1、由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。2、G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對(duì)真核細(xì)胞無作用而G418對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞

2、產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。3、匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100ug/ml1mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在1014天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。一個(gè)具體試驗(yàn)：3x106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合

3、度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。加藥時(shí)間和維持濃度1，由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每35天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。2，加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)

4、。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。篩選時(shí)的培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1， 死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液2 ，孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你

5、要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。3，適當(dāng)增加血清濃度。篩選時(shí)出現(xiàn)的問題及其解決辦法：1， 問題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細(xì)胞層，以減少可能殘

6、存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。我的建議：1、在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。2、把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆2，問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有7080，但

7、是想挑到表達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個(gè)可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣故。3，問題3。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。想請(qǐng)教各位有經(jīng)驗(yàn)的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細(xì)胞。不過，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。4，問題4。單克隆化的時(shí)機(jī)和個(gè)數(shù)：加藥篩選時(shí), 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)到70%以上時(shí),再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細(xì)胞, 同時(shí)要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?以防突變和污染。若細(xì)胞長(zhǎng)好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個(gè)克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見，篩10個(gè)吧。5，從單克隆化時(shí)開始，就要加大營

8、養(yǎng)，清和生長(zhǎng)因子。單克隆化的操作方法；1.方法1。單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個(gè)96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時(shí)候應(yīng)保證每個(gè)孔中的細(xì)胞是一個(gè),因此,我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個(gè)的細(xì)胞,這樣平均到每個(gè)孔中因該可以由滿意的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點(diǎn)的96孔板來補(bǔ)充。培養(yǎng)SPC-A1（人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫出來，希望對(duì)你有所幫助。2.方法2。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對(duì)96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，

9、并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml/孔，從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細(xì)胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會(huì)有某個(gè)孔中只有12個(gè)細(xì)胞。3.方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個(gè)細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號(hào)筆在皿底把單個(gè)熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺(tái)里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的

10、是：時(shí)間不能超過30min，否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時(shí)間長(zhǎng)的方法：拿一個(gè)96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了56次后非常熟練了培養(yǎng)液：最好是含15的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；另外一種方法是對(duì)還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長(zhǎng)因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。4.方法4。我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個(gè)，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時(shí)，即用10ul槍在顯微

11、鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。5.方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都是這樣：1。3.5cm皿鋪細(xì)胞，長(zhǎng)到大概80以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿（1：6）或者兩個(gè)大皿（1：12）。3。再過

12、一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。4。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細(xì)胞就形成單克隆。5，單克隆長(zhǎng)到相對(duì)較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個(gè)，種在兩塊24孔板上。6。于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結(jié)果確定真陽性。我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50就相對(duì)比較容易了，10以上的可能

13、最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽性也較少。對(duì)于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長(zhǎng)滿了就傳代），好像比較有效。除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時(shí)也多單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：1.單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。2.單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。3.篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。4.過

14、一段時(shí)間再篩選時(shí)，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫，此外，加藥后對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。5.穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再次篩選（需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。6.有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長(zhǎng)差不多

15、滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。單克隆化后鑒定：1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子,或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下!2.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系1.G418的配制：方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，濃度為100mg/ml，完全溶解后，0.22um過濾，

16、-20保存。方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（緩沖能力更強(qiáng)）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量較多）調(diào)節(jié)pH至7.3，過濾除菌（較難過濾），4保存，終濃度為1mol/L。（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），終濃度為500mg/ml，-20保存。注：實(shí)驗(yàn)中采用方案二時(shí)效果較好。2.制備篩選培養(yǎng)基：用培養(yǎng)基將G418稀釋為0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml

17、、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)，則每次換液需各個(gè)濃度培養(yǎng)基4ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。200 ug/ml        300 ug/ml        400 ug/ml        500 ug/ml        600 ug/ml        700 ug/ml       

18、 800 ug/ml        900 ug/ml        1000 ug/ml        1100 ug/ml        1200 ug/ml3ml完全培養(yǎng)基        998.4        997.6        996.8        996&

19、#160;       995.2        994.4        993.6        992.8        992        991.2        990.4G418(500mg/ml)       1.6ul       

20、; 2.4ul        3.2ul        4.0ul        4.8ul        5.6ul        6.4ul        7.2ul        8.0ul        8.8ul        9

21、.6ul3.細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài),鋪24孔板（20000/孔），12h換液，加篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。4.確定G418最佳篩選濃度：將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。 注：實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200ug/ml。             5.鋪6孔板（20萬/孔），第二天轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后換新鮮正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。注意：細(xì)胞數(shù)量不能

22、太多，否則將會(huì)影響篩選效果（G418很難發(fā)揮作用）。6.在換液一兩次后（換液后培養(yǎng)過夜），細(xì)胞達(dá)50%-80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心3000-4000rpm，吸上清0.22um過濾，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4備用。7.培養(yǎng)6天左右細(xì)胞大量死亡時(shí)，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基，即6中所配制?；蛘呖梢栽黾友鍧舛扰囵B(yǎng)，例如原來用10%血清，此時(shí)則可以采用20%血清。8.培養(yǎng)10天后將G418濃度減半，維持篩選壓力。9.篩選約14天后可見有抗性克隆出現(xiàn)。10.挑單克?。焊弑剁R下標(biāo)記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆，將其轉(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)。套環(huán)法：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加

23、胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)。刮除法：刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。11.單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá) western檢測(cè)目的基因。注意：轉(zhuǎn)染時(shí)壓系時(shí)細(xì)胞不能鋪的太滿，不然當(dāng)細(xì)胞連接緊密后，壓系時(shí)不具G418抗性的細(xì)胞死亡時(shí)極易將具有抗性的細(xì)胞一起從壁上脫落下來。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 一題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，

24、其藥理作用完全一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前的觀點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過，感覺都可以。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑，從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達(dá)不行。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。我個(gè)人覺得不必

25、要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開始，購買之前先下載個(gè)說明書看看。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。G418和篩選篩選之前由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在1014天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml1

26、000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對(duì)這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的。分子克隆給出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。細(xì)胞系或機(jī)體 G418濃度（ug/ml）中國倉鼠卵巢細(xì)胞700800Madin-Darby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV-1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬1035植物10酵母125500看下面的一個(gè)試驗(yàn)：3×106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時(shí)1/30

27、0細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50%！加藥時(shí)間由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3-5天都要更換一次含有G4

28、18的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆

29、的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的

30、基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。最全的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)！（2）Protocal 1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯

31、度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4.加G418篩選: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。6.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、6

32、00ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至5070匯合時(shí)；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選

33、濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測(cè)目的基因是否存在。常見問題：1.轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分

34、轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。2.neo基因和目的基因是不是一定會(huì)整合在一起？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用RT-PCR的方法進(jìn)一步鑒定。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。這個(gè)過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生

35、長(zhǎng)。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長(zhǎng)。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：再經(jīng)直徑0.22um濾器過濾，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩?#160;eeflying 1. G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至1000cell/mL，每孔100uL加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，10

36、0，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12個(gè)級(jí)別。培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-800左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。. 我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒有G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。 . 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期

37、之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。 操作用96孔板法，每代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進(jìn)行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過FISH驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)

38、胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。有時(shí)，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。 2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓100個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。我們用neo，實(shí)際

39、上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個(gè)紅球，另一次抓著10個(gè)紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。3. 維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持。可以再低些，但不能沒有。或者隔一定時(shí)間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實(shí)際上我們?cè)诤Y選耐藥株呀。4. neo的產(chǎn)物是酶，過高的G418濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們?cè)囘^，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃

40、度的G418液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。在第10天左右就手挑單克隆或者96孔板單克隆操作了本帖開始我就講了如何確定基準(zhǔn)濃度，篩選濃度是基準(zhǔn)濃度的高一級(jí)，維持用篩選濃度的一半。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 三 匯合度(confluence)也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí)際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比

41、例，如果細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器，我們就認(rèn)為它們100%匯合，也就是匯合度100%。最近的一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：3×106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小時(shí)后加g418篩選，這個(gè)時(shí)候接種了1/300細(xì)胞的孔會(huì)大約50%匯合，而理論上接種了1/4000細(xì)胞的孔會(huì)4%左右匯合，今天是篩選后第9天，觀察到1/4000孔有兩三個(gè)小克隆，按道理1/300孔會(huì)有20-30個(gè)克隆，但實(shí)際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！所以我認(rèn)為匯合度對(duì)g418篩選影響很大，這耽誤了我將一個(gè)多月。jiangql 同意菊花與刀對(duì)你的建議。我的感覺G418篩

42、選時(shí)間太長(zhǎng)，到后來一般會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響。以下是一些建議，供參考：首先需要擴(kuò)增細(xì)胞，凍存部分中間產(chǎn)物細(xì)胞后，再做克隆化比較合適，否則一旦污染就會(huì)全軍覆沒。一般57天后G418就可以減半維持。勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對(duì)存活細(xì)胞的影響。血清濃度可以高到20，質(zhì)量要好。 進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因（經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證）準(zhǔn)備真核表達(dá)載體將目的基因插入表達(dá)載體中轉(zhuǎn)染篩選鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。一、             試劑準(zhǔn)備1

43、、 HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調(diào)pH到7.4,補(bǔ)ddH2O至100ml, pH7.4，濾過除菌。2、核酸貯存液，過濾除菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。二、操作步驟（一）克隆目的基因1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在上、下游引物的5-端分別引入酶切位點(diǎn)BamH和Xho，行RT-PCR。2、回收特異性擴(kuò)增片段，連入T載體。3、轉(zhuǎn)化DH5，質(zhì)粒制備。4、酶切初步鑒定，測(cè)序證實(shí)。（二）      真核重組

44、表達(dá)載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及表達(dá)外源DNA序列所必需的所有真核表達(dá)組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamH和Xho雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5質(zhì)粒制備BamH和Xho雙酶切鑒定。（三）重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞：    1、 G418篩選濃度測(cè)定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。以10-14天細(xì)

45、胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為200mg/L。2、 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm），每孔1-2ml培養(yǎng)基3×105細(xì)胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細(xì)胞數(shù)量。                      典型貼壁細(xì)胞平板密度 培養(yǎng)板大小 生長(zhǎng)面積（cm2） 大

46、約細(xì)胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ml） 組織培養(yǎng)皿（60mm） 28 66×105 5-6 6孔培養(yǎng)板（35mm） 9.5 3×105 1-2 12孔培養(yǎng)板22.6mm） 4 13×105 05-1 24孔培養(yǎng)板（8mm） 05 06×105 025-05 3、 SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：(1)   轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時(shí)間內(nèi)，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。(2)   準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細(xì)胞系的最佳比例。 溶液A：用HBS稀釋DNA（pcDNA3、重

47、組pcDNA3）各1.5g 到總體積50l（30g/ml）。溶液B：用HBS稀釋6l脂質(zhì)體到終容積50l（120g/ml）?；旌先芤篈和B，輕柔混合（不要振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。(3)   不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100l 脂質(zhì)體/DNA混合物（從培養(yǎng)孔一邊到另一邊），邊加邊輕搖培養(yǎng)板。(4)   37孵育6hr。(5)   6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。(6)   轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。4、 G418篩選：在G4

48、18篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對(duì)照組細(xì)胞即SHG-44。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 四（一）篩選結(jié)果鑒定：（1）基因組DNA提取PCR鑒定外源基因（2）SHG-44-重組pcDNA3陽性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)（Western-blot）。（3）測(cè)定外源性基因?qū)HG-44細(xì)胞增殖的影響流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3單細(xì)胞懸液70%酒精固定裂解細(xì)胞核糖核酸酶消化碘化丙啶染色上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。細(xì)胞

49、生長(zhǎng)曲線測(cè)定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA35×104/孔接種24孔培養(yǎng)板24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率。軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3104 細(xì)胞0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)1-2周后計(jì)數(shù)不可少于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)計(jì)算克隆形成率抑制率。三、注意事項(xiàng)1、    優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件（脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間）每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用

50、應(yīng)在無菌條件下，這是細(xì)胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。2、    預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。3、    在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37預(yù)溫。4、    脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。 常見問題和解答：Q：我覺得套環(huán)法操作不如96孔辦法效率高。A

51、：也不一定.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求而定. 如果克隆效率較低的細(xì)胞,套環(huán)可能更好.用96孔板法,如果不是每孔單個(gè)細(xì)胞,就不能保證是單克隆.即使是增加到每孔十幾個(gè)細(xì)胞或上百個(gè),一個(gè)96孔板也只能培養(yǎng)一萬個(gè)細(xì)胞,十萬個(gè)細(xì)胞就至少需要10個(gè)板,100萬個(gè)細(xì)胞就需要100個(gè)板,對(duì)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶,工作量就太大了.且細(xì)胞在單獨(dú)生長(zhǎng)條件下,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如千萬個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好. 因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞,有限細(xì)胞系還是無限細(xì)胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少? Q：請(qǐng)問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的，含neo抗性基因的質(zhì)粒后，如何用G418篩選？我查看了

52、國內(nèi)、外50幾篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)定論的說法。即使對(duì)于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代后。不知這種觀點(diǎn)對(duì)不對(duì)。然而開始篩選的劑量、維持劑量以及篩選持續(xù)時(shí)間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時(shí)的劑量是否有一定關(guān)系？A：1. G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等2個(gè)級(jí)別, 培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)

53、，一般400-左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。 。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒有G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。 。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。 Q：請(qǐng)問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與目的基因表達(dá)的關(guān)系嗎？A：轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這

54、個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。操作用96孔板法，每代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，大多數(shù)凍存，留cell左右就可以進(jìn)行該操作了，該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述，我就不贅述了。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強(qiáng)了很多。現(xiàn)在很多代了，很穩(wěn)定。        Q：1。我的質(zhì)粒中含有SV40與neo基因，好像就不存在外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞形成優(yōu)勢(shì)這個(gè)問題了吧。 2。按您的講法，篩選要進(jìn)行10代

55、，那么維持劑量要進(jìn)行多長(zhǎng)時(shí)間？如果我使用對(duì)照組,在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？ 3。在細(xì)胞用胰酶進(jìn)行傳代時(shí)，此時(shí)細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng)基中存在G418對(duì)細(xì)胞是否有影響？ 4。既然細(xì)胞表達(dá)neo,從理論上講是否無論多大濃度的G418對(duì)之都無影響？A：1.可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過FISH驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同

56、一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。有時(shí)，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。 。那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。我們用neo，實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓

57、著個(gè)紅球，另一次抓著個(gè)紅球，可以肯定，的二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有?；蛘吒粢欢〞r(shí)間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實(shí)際上我們?cè)诤Y選耐藥株呀。 。neo的產(chǎn)物是酶，過高的G濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們?cè)囘^，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的G418液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論

58、的，用米氏方程理解吧。 。胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。    僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。Another answer:1.外源基因整合后的基因表達(dá)量與整合的位置高度相關(guān)，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)，則有利于表達(dá)。通常用的載體是靠非同源重組隨機(jī)整合的，所以為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，需要對(duì)重組克隆進(jìn)行篩選。某些載體如pcDNA3包含SV40的復(fù)制起始位點(diǎn)，可以是質(zhì)粒在反式提供大T抗原的細(xì)胞系中復(fù)制

59、，增強(qiáng)瞬時(shí)表達(dá)，有利于提高質(zhì)粒的隨機(jī)整合幾率。對(duì)普通的表達(dá)載體來說，即使抗性基因表達(dá)也無法保證外源基因的整合，表達(dá)載體隨機(jī)整合的結(jié)果常常導(dǎo)致目的基因的損壞甚至丟失。 。關(guān)于概率論的思維，我認(rèn)為紅球和黃球的比喻很形象，但未必準(zhǔn)確。因?yàn)榭剐曰蚝湍康幕蛴幸欢ǖ穆?lián)鎖，并不是完全相互獨(dú)立的。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系PROTOCOL1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確

60、定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4.加G418篩選: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。6.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400u

61、g/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至5070匯合時(shí)；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，P