PCR技術的過程和意義

1、PC限術的過程和意義一、PCRfc術的根本原理類似于DNA勺天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核昔 酸引物。PCR1一種體外DNA擴增技術，是在模板DNA引物和4種脫氧核甘酸存在 的條件下，依賴于DNAK合酶的酶促合反響，將待擴增的DNAt段與其兩側互補 的寡核甘酸鏈引物經高溫變性一一低溫退火一一引物延伸三步反響的屢次循 環(huán)，使DN*段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特 定基因片段。在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于一個復雜的混合物如細胞提取液中， 且含量很低，對于探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PC曲術可將靶序列放大幾個數(shù)量

2、級，再用探針雜交探測對被擴增序 列作定性或定量研究分析微生物群體結構。二、PC淑術的步驟PCRtt變性-退火-延伸三個根本反響步驟構成： 1、模板DNAB變性模板DNAS加熱至93c左右一定時間后，使模板 DNAK鏈或經PCFT增形 成的雙鏈DNA單離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反響作準備； 2、模板DNAtf引物的退火（復性）模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至 55c左右，引物與模板DNAI鏈 的互補序列配對結合； 3、引物的延伸DNA真板-引物結合 物在TaqDNAK合酶的作用下，以dNTF%反響原料， 靶序列為模板，按堿基配對與半保存復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互

3、補的半保存復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保 存復制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期 （Plateau） 所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 三、PCRfc術的意義1、特異性強PCRE響的特異性決定因素為：引物與模板DNA($異正確的結合；堿基配對原那么；Taq DN咪合酶合成反響的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原那么的。聚合酶合成反響的忠實性及 TaqDNAK合酶耐高溫性，使 反響中模板與引物的結合復

4、性可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大 增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 再通過選擇特異性和保守 性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 (pg=10-12量級的起始 待測模板擴增到微克以g二6水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在 病毒的檢測中，PCR勺靈敏度可達3個RFU空斑形成單位；在細菌學中最小檢 出率為3個細菌。3、簡便、快速PC阪響用而寸高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反響液加好后，即在 DNA 擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反響，一般在24小時完成擴增反響。 擴增產物一般用電泳分析，不一

5、定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4、對標本的純度要求低不需要別離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞， DNA粗制品及RNA勻可作為擴增模板。 可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNAT增檢測。四、PCRK術主要應用的領域1、核酸的根底研究：基因組克隆2、不對稱PCR®J備單鏈DNAffl于DNAW序3、反向PCRM定未知DNAg域4、反轉錄PCRRT-PCR用于檢測細胞中基因表達水平、RNAW毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCRffl于對PCR物實時監(jiān)控6、cDNAHC端快速擴增技術7、檢測基因的表達8、醫(yī)學應用：檢測細菌、病毒類疾??；診斷遺傳疾??；診

6、斷月中瘤；應用于法醫(yī) 物證學。五、關于RT-PCR4月17日，在北京檢驗檢疫局承當?shù)膰屹|檢總局科技方案工程“禽流感 病毒H7N9亞型雙重熒光RT-PCRS型技術研究鑒定會上，專家組一致認為：該 工程創(chuàng)新性地實現(xiàn)了對禽流感病毒 H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測中 確認樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病 毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術優(yōu)勢突出。專家組同意工程成果通過鑒 定，并建議在進一步擴大和完善動物臨床驗證實驗根底上，盡快推廣應用。RT-PCR為反轉錄 RCR reverse transcription PCR 和實時 PCRreal time PCR共同的縮寫。逆轉錄PCR或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)是聚合酶鏈式反響(PCR)的一種廣泛應用的變形。在 RT-PCR, 一條 RNAg被逆轉錄成為互補DNA再以此為模板通過PCR®T DNAT增。RT-PCRg 術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平， 細胞中RNAW毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNAff列。作為模板的RNA以