間接免疫熒光法測(cè)ANA

1、22021/4/27抗核抗體抗核抗體n【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體胞及其成分的抗體n【ANAANA】：指抗細(xì)胞核成分（】：指抗細(xì)胞核成分（DNADNA，RNARNA，蛋，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。白質(zhì)和酶）的抗體。ANAANA存在一個(gè)譜存在一個(gè)譜nANAANA新概念：抗核酸（新概念：抗核酸（Nucleic acidNucleic acid）和核）和核蛋白（蛋白（NucleoproteinNucleoprotein）抗體的總稱）抗體的總稱n某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富更豐富32021/4/27

2、ANA檢測(cè)的意義檢測(cè)的意義n有助于疾病的診斷 如抗Sm是SLE標(biāo)記抗體； 抗ScL-70 是SD的標(biāo)記抗體； 抗Jo-1是PM/DM的標(biāo)記抗體；n觀察疾病活動(dòng)度和治療反應(yīng)n研究發(fā)病機(jī)理42021/4/27【ANAANA分類分類】n抗抗DNADNA（dsDNA,ssDNA)dsDNA,ssDNA)n抗組蛋白（抗組蛋白（Histone)Histone)n抗非組蛋白（抗非組蛋白（Nonhistone,Extractable Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen, ENANuclear Antigen, ENA）n抗核仁（抗核仁（NucleolusNucleol

3、us）52021/4/27幾種ENA的由來及同義詞nSm：病人名：SmithnRNP: u1 RNP或nRNP Nuclear RibonucleoproteinnSSA: RO Sjogrens syndrome AnSSB: La, Ha, Sjogrens syndrome BnJo-1: 病人JohnnScL-70: Scleroderma62021/4/27【ANA ANA 由由 來】來】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補(bǔ)體均質(zhì)體LE細(xì)胞LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性?？笵NP取代LE細(xì)胞的檢測(cè)+7202

4、1/4/27ANA的篩選：間接免疫熒光法的篩選：間接免疫熒光法+抗原抗體（血清）抗原抗體第二抗體82021/4/27ANA的篩選：間接免疫熒光法92021/4/27實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片生物薄膜載片上的上的IgAIgA、IgGIgG、IgMIgM類類特特異性抗體異性抗體可以與可以與抗核抗原抗核抗原反應(yīng)；隨后反應(yīng)；隨后，結(jié)合抗體可與，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。102021/4/27抗原抗原人特異性抗體FITCFITC標(biāo)記的抗人抗體標(biāo)記的抗人抗體FITCFITC FITCFITC載片載片實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：

5、112021/4/27生物薄片馬賽克生物薄片馬賽克TM技術(shù)技術(shù)122021/4/27【實(shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)步驟】132021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備p檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時(shí)，可于3的Sekusept Extra （漢高公司）中浸泡1小時(shí)。p只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。142021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備l1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽性和陰性對(duì)照。對(duì)照血清使用前必須混勻。 152021/4/27實(shí)

6、驗(yàn)步驟三：加樣實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣n在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。n加樣體積: 25 l/反應(yīng)區(qū)(5 x 5 mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對(duì)照陰性對(duì)照162021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育n將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫（18-25）溫育30分鐘。172021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗n 用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水流水沖洗載片，然后立即立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少至少5分鐘分鐘。

7、182021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣n 將20l熒光標(biāo)記的抗人球蛋白熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完完全加完所有的二抗后全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育方可繼續(xù)溫育（最多可加50個(gè)載片）。建議使用連續(xù)建議使用連續(xù)加樣器加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻混勻。為為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。192021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育n 從PBS-Tween 清洗緩沖液中取出一張載片取出一張載片，5秒鐘秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面

8、和邊緣后，立立即即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。n注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。的間隙。n檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。n從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。n室溫溫育30分鐘分鐘。 202021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗n用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水流水沖洗載片，然后立即立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少浸洗至少5分鐘分鐘。n可在每150ml磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液中加10滴(150 l)伊文氏藍(lán)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染復(fù)染。212021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟九：

9、封片實(shí)驗(yàn)步驟九：封片n 在蓋玻片蓋玻片上滴加甘油甘油/PBS。n封片體積: 10 l/反應(yīng)區(qū)(5 x 5 mm)n從PBS-Tween 清洗緩沖液中取出一張載片取出一張載片，用紙擦干擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。區(qū)間隙。n將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。n然后再進(jìn)行下一個(gè)載片的操作。222021/4/27實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。 232021/4/27結(jié)果判讀：結(jié)果判讀：n熒光顯微鏡下觀察熒光顯微鏡下觀察n 細(xì)胞核發(fā)細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光黃綠色熒光為為陽性陽

10、性染色細(xì)胞，染色細(xì)胞，不不發(fā)熒光發(fā)熒光為為陰性陰性。n抗原片中出現(xiàn)陽性染色細(xì)胞為抗原片中出現(xiàn)陽性染色細(xì)胞為ANA陽性，陽性，否則為陰性。否則為陰性。n陽性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。陽性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。242021/4/27【均質(zhì)型】【均質(zhì)型】細(xì)胞核呈均勻一致的熒光細(xì)胞核呈均勻一致的熒光252021/4/27【核仁型】【核仁型】核仁部分呈現(xiàn)熒光核仁部分呈現(xiàn)熒光262021/4/27【斑點(diǎn)型】【斑點(diǎn)型】(顆粒型顆粒型)細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光272021/4/27【胞漿型】【胞漿型】282021/4/27【著絲點(diǎn)型】【著絲點(diǎn)型】292021/4/27

11、混合型：存在兩種以上的類型混合型：存在兩種以上的類型 混合型：存在兩種以上的類型混合型：存在兩種以上的類型302021/4/27ANA結(jié)果判斷結(jié)果判斷1：100 陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體1：100 陽性微量對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病1：320 陽性陽性提示某種風(fēng)濕病或其他疾病滴度定義：滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度312021/4/27【臨床意義】【臨床意義】n總的總的ANA檢測(cè)在臨床診斷與鑒別診斷中是一檢測(cè)在臨床診斷與鑒別診斷中是一個(gè)極

12、為重要的個(gè)極為重要的篩選篩選試驗(yàn)。絕大多數(shù)自身免疫試驗(yàn)。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽性。性疾病均可呈陽性。ANA陽性者進(jìn)一步檢測(cè)陽性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。n未經(jīng)治療的、活動(dòng)性未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽性率為的陽性率為80%100%。藥物性狼瘡。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混、全身硬皮病、混合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。性肝硬化等。n干燥綜合癥（干燥綜合癥（SS）、類風(fēng)關(guān)、橋本甲狀腺炎）、類風(fēng)關(guān)、橋本甲狀腺炎等。等。322021/4/27活動(dòng)性SLE （95-100%）非活動(dòng)性SLE （80-100%）藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡（ 100% ）混合結(jié)締組織病（ 100% ）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（ 20-40% ）其他風(fēng)濕性疾?。?20-50% ）進(jìn)行性系統(tǒng)硬化癥 （ 85-95% ）多肌炎、皮肌炎（ 30-50% ）干燥綜合征 （ 70-80% ）慢性活動(dòng)性肝炎（ 30-40% ）潰瘍性結(jié)腸炎（ 26% ）