構(gòu)建重組質(zhì)?；痉椒?頁

1、構(gòu)建重組質(zhì)?；痉椒?. cDNA編碼區(qū)片段的PCR擴(kuò)增50ul ×2模版 15引物 1 3引物 1dNTP 110×buffer 5Taq 1Milliq H2O 402PCR產(chǎn)物純化1、 加5倍體積的PB2、 將Spin柱放于2ml收集管上3、 加樣液，14Krpm，離心1min4、 棄去排出液5、 加0.75ml PE, 14Krpm，離心1min6、 棄去排出液,14Krpm,離心1min7、 將Spin柱放在潔凈1.5ml的Epp管中8、 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),靜置2min, 14Krpm，離心1min3雙酶切載體和PCR

2、產(chǎn)物分別用一下條件進(jìn)行雙酶切（反應(yīng)體系均為30ul，37，酶切n小時(shí)）：載體10ulPCR產(chǎn)物20ul10x buffer3ul10x buffer3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ulMilliQ H2O4.7ul4雙酶切后的載體用試劑盒割膠回收1. 割膠并稱重，加3倍體積的QG（膠塊每100mg約合100l的體積）2. 50，恒溫10min，等到膠完全被溶解3. 將一個(gè)Spin柱放在一個(gè)2ml的收集管中4. 加樣液，14Krpm，離心1min5. 棄去排出液6. 加0.75ml PE, 14Krpm，離

3、心1min7. 棄去排出液,14Krpm,離心1min8. 將Spin柱放在潔凈1.5ml的Epp管中9. 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),靜置2min, 14Krpm，離心1min5 連接上述雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化（其中載體酶切產(chǎn)物割膠回收，PCR片段酶切后純化步驟與上述PCR產(chǎn)物純化步驟相同），在T4 DNA連接酶作用下16連接過夜。連接體系如下：載體 2ulPCR 片段 6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6 轉(zhuǎn)化取上述連接液5l轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42熱激2min,置冰上5min，加入1m

4、lLB培養(yǎng)液37搖床45min，離心5000rpm，1-5min（不要離心太久，以免太實(shí)），最后均勻涂布在含有100 ng/ml抗生素的LB平板上（100-150 ul）。將平板在37倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆菌落轉(zhuǎn)劃到另一塊含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并對之進(jìn)行編號，37倒置培養(yǎng)過夜。7菌落原位PCR挑取轉(zhuǎn)劃后長出的陽性克隆菌落，加入3ul細(xì)菌DNA提取液破細(xì)胞。將細(xì)菌裂解液作為PCR模板，其他PCR組分及PCR條件同上。PCR產(chǎn)物在2%凝膠上進(jìn)行電泳分析。8. QIAGEN試劑盒抽提質(zhì)粒1) 用1.5ml管離心收集細(xì)菌，兩次，共3ml左右。2) 加入250ul的預(yù)冷的P1，打勻后在震蕩儀上高速震蕩1min。3) 加入250ul P2，溫和顛倒數(shù)次混勻。4) （在5min內(nèi)）加入冰上預(yù)冷的溶液 N3 350ul，迅速溫和顛倒混勻，至出現(xiàn)分散的絮狀沉淀。5) 冰上靜置2min后離心，13，000rpm，10min。6) 小心吸取上清于藍(lán)色的spin柱中（勿吸到沉淀）7) 離心13，000rpm，1min，棄流出液8) 加入750ul PE，離心13，000rpm，1min，棄流出液9) 再離心一次，離心13，000rpm，1min，棄流出液。以讓管內(nèi)徹底干燥。10) 將spin柱拿出，置于一干凈的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加