分子生物學技術(shù)在食品工業(yè)中的最新研究進展

1、分子生物學技術(shù)在食品工業(yè)中的最新研究進展 0引言了解食品中的微生物群落組成以及不同微生物種群之間的相互作用，對于生產(chǎn)出安全和高品質(zhì)的食品是非常重要的。食品生產(chǎn)過程中相關微生物的研究通常采用培養(yǎng)的方法，但這種方法存在很大的局限性：富集培養(yǎng)大多具有選擇作用，導致不能分離出具有重要生態(tài)學作用、數(shù)量相對較少的種群，不能定量研究微生物種群的動態(tài)變化；受到食品環(huán)境脅迫或受損的微生物細胞，通常需要特殊的培養(yǎng)條件才能恢復生長，導致其難以被分離。大量的研究表明，傳統(tǒng)的微生物學培養(yǎng)分析方法，獲得的可培養(yǎng)微生物種群只占微生物總量的0.1%-5%。盡管對于微生物群落結(jié)構(gòu)相對簡單的食品來說（如發(fā)酵食品），可培

2、養(yǎng)的微生物一般占有優(yōu)勢，但Ampeul認為，至少有25%50%的微生物種群不能被培養(yǎng)。這種缺陷促進了以聚合酶鏈反應(PGR)技術(shù)為基礎的分子免培養(yǎng)方法和核酸檢測技術(shù)在食品微生物研究中的應用和發(fā)展。與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，分子生物學技術(shù)具有快捷、靈敏、準確等優(yōu)點，而且具有更高的特異性，能夠更加精確地研究生態(tài)系統(tǒng)中的微生物多樣性及其群落組成。微生物學家已經(jīng)認識到研究微生物生態(tài)學概念和理論，對于了解食品中微生物的繁殖與生長非常重要。譬如研究微生物群落組成能夠更好地了解奶酪、酸奶、香腸、葡萄酒、面包等食品的風味組成以及微生物對其儲藏品質(zhì)的影響；密切監(jiān)測食品生產(chǎn)過程中微生物群落的動態(tài)變化，能夠更好地了解和控

3、制食品加工和后熟過程中的微生物作用；可以快速、準確地監(jiān)測食品中可能存在病原微生物，以加強食品生產(chǎn)過程中的安全性等。因此，在種、菌株水平上，對食品環(huán)境中微生物的準確監(jiān)測和可靠鑒定以及微生物群落組成、動態(tài)變化的生態(tài)學研究，有助于保證食品的質(zhì)量安全。與土壤、水環(huán)境等生態(tài)系統(tǒng)的研究相比，到目前為止，用于食品加工過程中微生物研究的分子生態(tài)學的方法還相對較少，目前使用最多的是變性梯度凝膠電泳技術(shù)。盡管如此，這些方法在食品工業(yè)中（尤其在發(fā)酵食品中）正逐漸被使用。    中國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)歷史悠久，品種多樣，如食醋、醬油、白酒、黃酒、豆豉、腐乳、酸菜、乳酪以及發(fā)酵肉

4、制品等。傳統(tǒng)發(fā)酵食品工藝多為天然發(fā)酵，其微生物群落結(jié)構(gòu)比較復雜，產(chǎn)品風味具有明顯的地域性。傳統(tǒng)的發(fā)酵行業(yè)對釀造工藝過程中的微生物群落動態(tài)變化、風味及功能性物質(zhì)的形成和累積機制的研究明顯滯后，對傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的機制缺乏深入了解。以天然的復雜菌種混合發(fā)酵工藝為主的絕大多數(shù)企業(yè)，其生產(chǎn)質(zhì)量控制主要靠工程技術(shù)人員長期工作積累的經(jīng)驗來判斷，難以對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)進行穩(wěn)定的控制。分子生態(tài)學技術(shù)能夠?qū)Πl(fā)酵過程進行定量監(jiān)控，通過檢測發(fā)酵過程中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)、種群動態(tài)變化情況，有助于從整體上進行全面的分析，深入認識微生物的發(fā)酵機制，并為監(jiān)控和調(diào)整發(fā)酵過程奠定基礎。1  目標基因的選擇自20世

5、紀80年代中期以來，PCR技術(shù)已成為科學家們用來研究微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的最主要工具。一般而言，以DNA為模板，利用通用引物通過PCR反應擴增目標基因，產(chǎn)生的基因序列大小相同，因此需要依據(jù)基因序列的差異來區(qū)分不同的微生物。所以，分子生態(tài)學研究的關鍵步驟就是選擇合適的目標基因。合適的目標基因既要有保守區(qū)段，又要有可變區(qū)段?？勺儏^(qū)段可以在不同的分類水平上區(qū)別微生物，保守區(qū)段位于可變區(qū)段兩側(cè)，用來作為引物復性結(jié)合的位點進行PCR。如果沒有高度保守區(qū)域，較低保守程度的區(qū)段也可作為簡單引物退火結(jié)合的位點。通常在分子生態(tài)學研究中，主要采用能夠反映微生物系統(tǒng)發(fā)育關系的、在微生物基因組中普遍存在的基因作為P

6、CR擴增的首選目標。此外，編碼蛋白的功能基因也可被用來研究微生物類群的功能多樣性。    目前，由于細菌rRNA操縱子（包括16S rRNA基因、23S rRNA基因以及基因間隔序列，IGS）在所有的微生物類群的基因組中都存在，而且符合以上微生物分子生態(tài)學研究作為分子標記的條件，是目前微生物生態(tài)學研究中最常用的分子標記。尤其在RDP等基因序列數(shù)據(jù)庫中，已經(jīng)積累了幾千萬的基因序列，能夠很方便地通過比較來描述某一群落中存在的微生物種群。目前發(fā)現(xiàn)，rRNA基因序列有時并不具有足夠的序列差異來區(qū)別親緣關系很近的、占據(jù)不同生態(tài)位的分類單位。Palys等人在研究相近

7、群落中一些細菌的生態(tài)多樣性時，證明蛋白質(zhì)編碼基因序列比16S rRNA基因更為有效。此外，由于大多數(shù)細菌基因組中rRNA基因存在多個拷貝，其序列的差異使得分子生態(tài)學結(jié)果的解釋和分析復雜化。因此，單拷貝的、不同分類單位之間顯示較大序列差異的持家基因越來越受到更多的關注，這些基因包括促旋酶基因(gyrB)、延長因子基因(tuf）、熱激蛋白基因(dnaK)、RNA聚合酶基因(rpoB)以及reeA基因等。然而，與16S rRNA基因相比，這些基因在數(shù)據(jù)庫中目前只有少量的序列，這使得它們在微生物生態(tài)學中的應用受到很大的限制。對于特定環(huán)境中某個具體的微生物生態(tài)學過程，可以通過分析生態(tài)學過程中發(fā)揮關鍵作用

8、的功能酶基因的多樣性以及確定優(yōu)勢基因的多態(tài)性來監(jiān)測生態(tài)系統(tǒng)的功能多樣性。對于土壤和水環(huán)境而言，功能多樣性分析過程主要包括氮素循環(huán)、硫酸鹽還原、氨氧化以及多環(huán)芳烴化合物的降解等。就目前來看，雖然已有一些利用功能基因來分析檢測和鑒別食源性人類病原體的報道，但迄今為止，還沒有在食品工業(yè)中利用功能基因多樣性進行食品微生物生態(tài)學作用研究的報道。這方面有待深入研究。2食品微生物群落分析技術(shù)研究微生物群落一般采用3個基本指標，即多樣性、相似度和豐度。目前用于微生物群落分析的大多數(shù)分子技術(shù)并不全面，只能從一個側(cè)面幫助了解微生物群落。基于PCR技術(shù)研究微生物群落的方法有：利用通用引物擴增產(chǎn)生混合PCR產(chǎn)物，再通

9、過其他技術(shù)進一步分析；通過特異性的PCR反應檢測和定量特殊功能類群的微生物或目標基因。分子生物學技術(shù)在食品工業(yè)中的最新應用研究見表1。2.1食品微生物多樣性研究方法2.1.1  變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)，通過PCR擴增相同長度的的DNA片段(200-700 bp)，其PCR正向引物的5 7末端帶上一個3540 bp的GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)，以保證擴增的DNA片段在變性凝膠中至少能保持部分的雙鏈結(jié)構(gòu)。依據(jù)DNA序列差異具有不同的變性濃度或者溫度，在變性劑梯度或者溫度梯度的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，

10、檢測微生物多樣性。理論上，可以檢測和區(qū)分只有1個或幾個堿基對差異的核核酸片段。1999年DGGE技術(shù)首次應用于食品微生物學，Ampe1研究了墨西哥玉米發(fā)酵面團中的微生物空間分布。此后，DGGE技術(shù)被廣泛應用于分析食品及其相關產(chǎn)品的微生物群落組成差異及監(jiān)測微生物種群數(shù)量動態(tài)變化，包括礦泉水、葡萄酒、香腸、乳制品、發(fā)酵木薯面粉、牛肉、魚等。16S rRNA基因V3區(qū)段由于長度與序列的種屬差異使得該區(qū)段在食品微生物DGGE/TGGE技術(shù)中作為首選的目標序列。最近，一些DGGE技術(shù)以mRNA進行PCR來研究生理代謝活躍的種群多樣性。DGGE技術(shù)和TGGE技術(shù)的主要優(yōu)點是在許多分子實驗室都可以進行，而且

11、結(jié)果的解釋相對簡單。但是，由于PCR產(chǎn)物片段很短，序列所含信息較少，使得微生物的分類鑒定準確度降低；而且，不同的序列可能有相同的電泳遷移率，導致了不同片段的共遷移。DGGE/TGGE技術(shù)的最主要缺點是缺乏可重復性，另一個缺點是普通凝膠的染色方法使得其靈敏度較低，導致一些代表稀有種群的帶丟失，使用熒光標記的引物可提高檢測的靈敏度。2.1.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)另一種依賴于PCR產(chǎn)物電泳分離，并已用于微生物群落分析的技術(shù)是單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)。與DGGE/TGGE技術(shù)不同，SSCP技術(shù)以單鏈折疊產(chǎn)物的構(gòu)象差異為基礎分離PCR產(chǎn)物。變性后，單鏈DNA片段在非變性條件下，由于核苷酸序列不同

12、，形成的二級結(jié)構(gòu)不同，分子量相近的產(chǎn)物被分離。一般情況下，SSCP與DGGE/TGGE技術(shù)具有相同的優(yōu)缺點。由于引物不需要帶發(fā)卡結(jié)構(gòu)，PCR擴增結(jié)果比DGGE或TGGE更有效。SSCP技術(shù)主要的缺點是由一個單鏈DNA片段可能會形成幾個穩(wěn)定的構(gòu)象，導致凝膠中出現(xiàn)多個帶。此外，在分析多樣性較高的復雜微生物群落時，需要上載較高濃度DNA樣品，DNA單鏈在電泳時重新復性的概率很高。SSCP已被用于研究不同環(huán)境中的微生物群落，但在食品工業(yè)的應用中，目前僅限于干酪微生物的研究。2.1.3末端限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性T-RFLP是另一種以PCR技術(shù)為基礎的群落帶譜分析法，通常用于比較分析微生物群落。目標基

13、因首先被熒光標記的引物擴增（只有1個引物被標記），然后酶切，最后在自動測序儀上分離和檢測。在電泳峰圖中，只有被標記的末端限制性內(nèi)切酶片段能被檢測出，其長度的不均勻性表明群落的復雜性。選擇的限制酶越多，T-RFLP的檢測靈敏性越高，能夠檢測單個堿基差異的核酸片段，而且能夠很好的同時檢測大量的樣品，譬如確定多個樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的時空變化。這種方法在精確預測微生物群落結(jié)構(gòu)有一定局限性，由于不完全或非特異的限制性酶切，產(chǎn)生假的限制性片段，導致微生物多樣性的過高估計。另一個限制因素是軟件預測和實驗獲得的限制性片段實際長度之間的差異。此外，一個不確定因素是由于熒光染料的選擇引起的，要仔細的評估引物和標記

14、染料，優(yōu)化實驗方法。盡管存在缺陷，T-RFLP還是一種非常有效的微生物群落分析的分子技術(shù)，尤其需要高通量和高靈敏度分析時，不需要直接的序列信息。T-RFLP技術(shù)的有效性在微生物生態(tài)學中不同研究領域已經(jīng)得到廣泛的體現(xiàn)，在食品工業(yè)中，T-RFLP技術(shù)也被越來越多的成功應用于微生物群落分析，譬如水產(chǎn)業(yè)、酸奶和奶酪生產(chǎn)以及制糖工業(yè)。2.1.4擴增核糖體DNA限制性分析擴增核糖體DNA限制性酶切分析(ARDRA)，也被稱為16S rRNA基因的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，是一個相對簡單的PCR技術(shù)為基礎的指紋圖譜技術(shù)，先酶切PCR擴增的群落rDNA，然后通過凝膠電泳分離。這種技術(shù)能夠被用于微生物鑒

15、定，也可以比較微生物群落和動態(tài)變化。與T-RFLP技術(shù)不同，檢測到所有的酶切片段，雖然提高了分辨水平，但增加了圖譜的復雜性，不能有效的比較和解釋圖譜。由于單個限制性內(nèi)切酶不具有高的分辨力，多個限制性內(nèi)切酶單獨或者組合使用有可能獲得較好的結(jié)果。該技術(shù)另外一個缺點是由于凝膠中染色劑的檢測靈敏度有限，導致微生物群落中豐度較低種群不能檢出和系統(tǒng)發(fā)育信息的丟失。因此，只有在分析組成相對簡單的群落時，該技術(shù)才被首選。目前，還沒有發(fā)現(xiàn)該方法用來研究食物中微生物多樣性的報道。2.1.5核糖體間隔區(qū)分析微生物核糖體基因間隔區(qū)(IGS)在長度和核苷酸序列上比16S rRNA和23S rRNA基因具有更大的差異（長

16、度一般在400-1 200堿基），因此在菌株水平上被廣泛用來對微生物進行分型研究。自動核糖體間隔序列分析技術(shù)(ARISA)就是用熒光標記的通用引物PCR擴增群落總DNA中各種細菌的16S rRNA和23S rRNA基因之間的序列，隨后在自動化系統(tǒng)上進行凝膠電泳分離，激發(fā)光檢測代表不同種類微生物的大小不一的DNA擴增片度。ARISA技術(shù)檢測微生物存在的問題是PCR可能優(yōu)先擴增短的模板。此外，由于在同一種微生物基因組中存在多個核糖體基因操縱子，其中IGS序列長度差異的存在，可能使一種微生物產(chǎn)生多個檢測信號而產(chǎn)生偏差。為了提高實驗重復性和標準化操作，Cardinale評價了不同引物組合的適用性、靈敏

17、度、重復性，以及環(huán)境微生物群落ARISA分析最適的引物的選擇。同DGGE/TGGE、T-RFLP技術(shù)一樣，ARISA技術(shù)已經(jīng)成為研究微生物生態(tài)學的常用方法。雖然在食品微生物分離菌株的分子分型研究中，間隔序列分析技術(shù)(RISA)被經(jīng)常使用，到目前為止，被用于食品微生物群落分析的研究報告僅有1例，即用于山羊奶微生物分析。2.2食品微生物類群鑒定目前，對于許多食品及其加工工藝中存在的微生物研究，不僅要了解其中微生物多樣性以及不同樣本之間的群落差異，還要了解發(fā)揮最關鍵作用的微生物類群。例如了解生產(chǎn)中不利于食品加工的微生物、產(chǎn)生干酪獨特風味和口感的關鍵微生物類群等。2.2.1  克隆

18、文庫法要獲知群落中微生物的組成，可以采取割膠純化泳帶、克隆測序法，也可以通過PCR擴增產(chǎn)物直接克隆和測序，確定群落的微生物物種組成。目前許多研究通過16S RNA基因克隆文庫構(gòu)建、序列比對、數(shù)據(jù)庫搜索來研究食品基質(zhì)中微生物。目前，由于高通量測序技術(shù)的長足進展，數(shù)據(jù)庫中大量序列信息的累積儲存，使得克隆文庫法更容易應用，但該技術(shù)比較繁瑣、費時，尤其在處理多個樣品時，有時需要測序幾千個克隆子，以便盡可能多覆蓋群落中隱藏的微生物信息。雖然可以采取酶切鑒別克隆子的方法減少克隆測序的工作量，但可能丟失基因序列代表的食品微生物信息。因此，克隆文庫法可以與指紋技術(shù)（包括DGGE，T-RFLP，SSCP等）聯(lián)合

19、使用，用以研究較為復雜的食品基質(zhì)中的微生物群落，以便確定大致所需要測序的克隆子數(shù)量。目前，最有希望推廣的測序技術(shù)是費用相對低廉的、高通量的焦磷酸測序技術(shù)，最大的優(yōu)勢是不需要克隆，可以避免異常重組的產(chǎn)生和人為因素造成的克隆偏差。該技術(shù)已應用于環(huán)境微生物研究，目前還沒有應用該技術(shù)研究食品微生物群落的報道。2.2.2  DNA微陣列技術(shù)DNA微陣列技術(shù)最初用于研究基因表達或單核苷酸多態(tài)性分析，尤其適合一個樣品中許多未知DNA序列鑒定。此項技術(shù)基于特異的寡核苷酸探針被固定在固相載體上與被檢測的同源標記的目標擴增子雜交，已被證明是環(huán)境中微生物鑒定的最成功的方法，即使檢測樣品中種群之間

20、只有1個單核苷酸差異。DNA微陣列技術(shù)克服了許多指紋圖譜分辨率低、需要樣品大以及克隆測序成本高的弱點，而且，由于雜交信號與靶DNA數(shù)量成正比，該技術(shù)還能進行定量研究?；跈z測的靶基因，DNA陣列一般可分為3類：以16S rRNA基因為靶基因的系統(tǒng)發(fā)育類群微陣列，主要用于微生物多樣性研究；功能基因陣列，用于檢測特定環(huán)境中的關鍵功能基因；宏基因組微陣列，直接固定環(huán)境中提取的DNA片段，檢測未知基因序列。在食品中，DNA陣列技術(shù)被成功用于直接檢測氣調(diào)包裝蔬菜沙拉中的微生物群落以及高糖果汁貯存過程中的微生物種群。此外，DNA陣列技術(shù)已被廣泛用于包括食品在內(nèi)的各種環(huán)境中病原微生物的檢測。DNA陣列技術(shù)最

21、大的優(yōu)勢就是可以通過開發(fā)寡核苷酸探針無限的擴大檢測能力和檢測范圍，但存在的缺陷是無法檢測還沒有特異寡核苷酸探針的微生物類群。2.2.3  熒光原位雜交技術(shù)(FISH)熒光原位雜交技術(shù)是綜合了顯微鏡觀察的簡捷性和DNA雜交的特異性的一種分子技術(shù)，一般是利用熒光標記的DNA探針與特殊類群微生物的核糖體基因的某個特異區(qū)段雜交，然后通過熒光顯微鏡或者流式細胞儀直接檢測樣品中微生物的豐度。該技術(shù)通過對原位樣品盡可能小的擾動，廣泛應用于環(huán)境微生物研究。在食品微生物研究中，被用來檢測酒中的乳酸菌、奶酪亞表面存在微生物以及發(fā)酵食品中的益生雙歧桿菌等。目前，熒光原位雜交技術(shù)最新的研究進展是用

22、分子信標取代線性的寡核苷酸探針，具有更好的區(qū)分能力。此外，利用分子信標技術(shù)減少了洗滌的步驟，從而減少了細胞的凝集成團和損失，有助于更精確的計數(shù)。理論上，熒光原位雜交技術(shù)可以檢測樣品中的單個細胞，然而在實踐中，檢測水平大約是1 000個細胞/mL。因此，相對于PCR為基礎的檢測技術(shù)，熒光素原位雜交技術(shù)的檢測靈敏度較低。另一個局限性是高通量樣本檢測時，自動化程度不高。要深入了解微生物群落，就要在更高分辨水平上設計許多的探針，因此探針的設計對于FISH技術(shù)的有效應用是一個瓶頸。2.3食品微生物定量研究對微生物研究來說，除了了解一個群落的組成及其中占優(yōu)勢的種群之外，在更多情況下還要了解某個種群的數(shù)量大?。ㄘS度），而PCR擴增的非線性使得確定原始樣品中DNA量與最終獲得序列的量之間的相關性分析成了問題。因此，基于PCR的指紋圖譜技術(shù)（如DGGE，T-RFLP技術(shù)）以及DNA陣列技術(shù)都可以看作是半定量的。目前，通過實時定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)可以實現(xiàn)樣品DNA的精確定量。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，Real-time PCR基于熒光