重組腺病毒構(gòu)建,擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作

1、重組腺病毒構(gòu)建，擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作Cloning Gene of InterestHomologous Recombination in vivo in BacteriaDigest with Pac IVirus Production in AD-293 Cells目的基因的克隆（以 pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）1. 選擇適當(dāng)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切連接，將目的片段插入 pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)。2. 重組質(zhì)粒鑒定：酶切鑒定或測(cè)序。3. 重組質(zhì)粒擴(kuò)增，純化并準(zhǔn)備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。4. 用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開(kāi)。5. 膠回收線性化質(zhì)粒，

2、以備共轉(zhuǎn)化使用。二共轉(zhuǎn)化1大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備2 從新鮮瓊脂板上挑取單個(gè) BJ5183細(xì)菌，接種于LB培養(yǎng)基中，37 C振搖過(guò)夜。2 接種25ml過(guò)夜培養(yǎng)物于 500ml LB培養(yǎng)基，37 C振搖，至 OD600 達(dá)到0.4。2迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中 30min ,至充分冷卻。2將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4C下以2500r/min離心15 min ,棄培養(yǎng)液，回收細(xì)胞。2 以10ml預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。2 加約1ml （適量）預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液 100倍，測(cè)量OD600，至稀釋濃度為2-3 X1010個(gè)細(xì) 胞/ ml （1.0 OD600

3、 約2.5 X1010個(gè)細(xì)胞/ml）。分裝，-80 C或液氮保存待用。2病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增，純化。3將1-5 4 （約1四）線性化的穿梭質(zhì)粒及 1小（約100ng/ M）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1 ）加入至含約40 gl BJ5183 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻，冰上冷卻。4 將混合物加入電轉(zhuǎn)杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms ）。5電擊結(jié)束取出樣品，加入 1ml SOC或LB培養(yǎng)液，37 C低速振蕩40min。6取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂于數(shù)個(gè)卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml ） , 37 C培養(yǎng)16-20hr。7次日挑取平板上長(zhǎng)出的菌落（選擇最小的菌落）

4、，接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基，37 C培養(yǎng)10-15hr。8堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒為可能陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步酶切鑒定。以 PacI單酶切，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb ），及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時(shí)可進(jìn)行其它酶切鑒定），則基本確定為陽(yáng)性克隆。9取1-5 4陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5a大腸桿菌細(xì)胞（BJ5183為recA+，質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，DH5a或JM109, XL1-blue 菌株為重組缺陷性菌株，可穩(wěn)定擴(kuò)增已鑒定的重組質(zhì)粒），擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。三重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo) 293細(xì)胞1 293細(xì)胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)導(dǎo)24

5、小時(shí)前，以方瓶為例，接種2X106 293細(xì)胞于25cm2方瓶，使生長(zhǎng)密度約50-70%。（也 可以使用6孔或96孔板）2以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉(zhuǎn)導(dǎo) 25cm2方瓶約需4ggDNA ），完全線性化后，乙醇沉淀，再以 20 lddH2O 溶解。3脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以 Lipofectamine為例）：每4 gg PacI約需20 M Lipofectamine包裹.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于 500 gl無(wú)血清培養(yǎng)基再混合，置于室溫下15-30min。4以無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶，另加 2.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基，37 C放置10min。5 將Lipofectamine-DNA 混合物加入培養(yǎng)瓶

6、，37 C孵箱放置 4hr。6 4hr后，棄Lipofectamine-DNA 混合液，另加入 6ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FCS ）。如有大量細(xì)胞漂浮， 可不棄Lipofectamine-DNA 液，加入6ml DMEM 完全培養(yǎng)基，37 C孵育過(guò)夜，再換液。7培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。約2周后可觀察到細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)（如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒，由于含GFP ,可觀察到綠色熒光）。四重組病毒鑒定1轉(zhuǎn)導(dǎo)10-14d后，收集細(xì)胞沉淀，加入 2ml滅菌的PBS混懸，凍融細(xì)胞，離心后收集上清保存于-80 C。2取30-50%步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方

7、瓶中293細(xì)胞。2-3d后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。3感染后3-5d,當(dāng)1/3-1/2細(xì)胞漂浮時(shí)收集病毒。按步驟 1收集細(xì)胞并準(zhǔn)備病毒上清。通過(guò) Western blot和/或PCR 鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。4 PCR鑒定重組病毒。取5卬1病毒上清加入10 W蛋白酶K, 55 C孵育1hr,再煮沸5min，離心后取1-2 作PCR。五重組病毒擴(kuò)增，純化1 75cm2方瓶中接種293細(xì)胞，至密度達(dá)到90%，加入適量病毒上清感染細(xì)胞。3-4d后，細(xì)胞幾乎變圓，且有一半細(xì)胞漂浮，則收集所有細(xì)胞。約500g轉(zhuǎn)速離心，棄上清。2以滅菌PBS重懸沉淀，反復(fù)凍融 4次。4C下7000g離心5min.病毒純化至少需要 3

8、0瓶75cm2方瓶細(xì)胞。3 CsCl連續(xù)梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于 SW41轉(zhuǎn)頭）中，覆蓋約 2ml礦物油。平衡后，10 C下32000 rpm離心18-24hr ,用注射器抽吸離心出的病毒帶。（也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入 8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl , pH=7.9）, 上面小心加入 6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl , pH=7.9），再小心加

9、入病毒上清液至體積達(dá)到20ml。平衡后，4C下23000rpm離心90min （SW28轉(zhuǎn)頭），用注射器抽吸下層藍(lán)白色病毒帶）4病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose ），滅菌處理。4C透析，更換 3次 透析液，可基本去除 CsCl，病毒保存于-80 C o六病毒滴度測(cè)定（TCID50 ）1細(xì)胞準(zhǔn)備:96孔板中接種100卬l 293細(xì)胞,每孔細(xì)胞數(shù)約104個(gè)，以2% DMEM培養(yǎng)2稀釋病毒液準(zhǔn)備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個(gè)較高濃度（如10-3-10-10 ），每個(gè)濃度重復(fù)10個(gè)，每孔加 入病毒稀釋液100卬l。另留兩排不加病毒液作為陰性對(duì)照。37C下，孵箱培養(yǎng)10天。3 10d后觀察細(xì)胞，記數(shù)每排出現(xiàn) CPE的孔數(shù)，計(jì)算細(xì)胞病變率。（如某一濃度各孔細(xì)胞全部病變，比率為1,如無(wú)細(xì)胞病變，則比率為 0）。4 計(jì)算 T =10 X101 + d （