高效液相色譜和氣相色譜的異同點(diǎn)

1、高效液相色譜和氣相色譜的異同點(diǎn)不同點(diǎn)：一、流動(dòng)相不同：HPLC為液體流動(dòng)相，GC為永久性氣體作流動(dòng)相（通常叫做 載氣）二、進(jìn)樣器不同：高效液相為平頭進(jìn)樣針，氣相色譜為尖頭進(jìn)樣針三、色譜柱長(zhǎng)不同：（1）氣相色譜柱通常幾米到幾十米（氣相色譜由于載氣的相對(duì)分析量較低，分子間隙大，故粘度低，流動(dòng)性好，組分在氣相中流動(dòng)速度快，因此可以增加柱長(zhǎng)，以提高柱效）。（2）液相色譜柱通常為幾十到幾白毫米四、分析種類(lèi)有差異：氣相色譜分析的對(duì)象多為（不適絕對(duì)）：分子質(zhì)量小于1000,低沸點(diǎn)，易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性好的化合物。液相色譜：更適用于分析高沸點(diǎn)，難揮發(fā)，熱穩(wěn)定性差，分子質(zhì)量較大（1000 -2000）的液體化合物。

2、五：樣品柱前變化不同：氣相色譜的樣品在柱前必須變?yōu)闅怏w（氣化室汽化）， 而液相色譜的樣品在柱前則無(wú)變化。六、所用檢測(cè)器有差異：液相主要為：紫外檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器.氣相色譜主要為：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD），電子捕獲 檢測(cè)器（ECD ），火焰光度檢測(cè)器（FPD），氮磷檢測(cè)器（NPD）.相同點(diǎn)：基本原理相同。都是利用物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)的差別，從而在兩相問(wèn)反復(fù)多次 （1000-1000000次，甚至更多）的分配，使原來(lái)分配系數(shù)差別很小的各組分分 離開(kāi)來(lái)。Owen發(fā)現(xiàn)異卵雙生牛的天然免疫耐受現(xiàn)象（1945）,明確自身識(shí)別問(wèn)題， 伯耐特（Burnet

3、 , 1949）提出免疫耐受理論，梅德華（Medawar , 1953）實(shí) 驗(yàn)證實(shí)胚胎期耐受理論。耶那（Jerne , 1955）提出天然抗體選擇學(xué)說(shuō)，完 成免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)（1974）,伯耐特等（Burnet & Talmage, 1957）完善克隆選 擇學(xué)說(shuō)等免疫防御（immunologic抗感染defense）免疫穩(wěn)定（immunologic 消除炎癥或衰老細(xì)胞 homeostasis）免疫監(jiān)視（immunologic 控制癌變細(xì)胞 surveilance）1. 高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱(chēng) 為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較 大，為了迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液 施加高壓。

4、一般可達(dá)1503.5萬(wàn)KPa。2. 高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)110ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液 相色譜法少得多，一般少于1h 。3. 高效：近來(lái)研究出許多新型固定 相，使分離效率大大提高。4. 高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采 用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析 的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá) 10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5. 適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液 相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方 便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn) 太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng) 用氣相色譜法進(jìn)行分析

5、。而高效液相色譜 法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)?化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高 沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于 400以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有 機(jī)物總數(shù)的75%80% ）原則上都可應(yīng) 用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分 析的約占20%,而能用液相色譜分析的約 占7080%高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分 為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、 反相高效液相色譜、高效離子交換液相色 譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相 色譜等類(lèi)型。用不同類(lèi)型的高效液相色譜 分離或分析各種化合物的原理基本上與相 對(duì)應(yīng)的普通液相頃的原理相似。其不同 之

6、處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率 高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。編輯本段主要類(lèi)型及其分離原理根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜 法可分為下述幾種主要類(lèi)型：1 .液一液分配色譜法(Liquid-liquid PartitionChromatography)及化學(xué)鍵合相色譜 (Chemically Bonded Phase Chromatography)流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與 固定相之間應(yīng)互不相溶(極性不同，避免 固定液流失)，有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng) 試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。 達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式：式中，cs溶質(zhì)在固定相中濃度；cm- 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度；Vs 一固

7、定相的體積；Ve流動(dòng)相的體積。LLPC與GPCW相 似之處，即分離的順序取決于K, K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì) K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì) K影 響較大。a. 正相液一液分配色譜法(NormalPhase liquid Chromatography):流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b. 反相液一液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。c. 液一液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管 流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但 固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定 液流失

8、。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合 固定相(見(jiàn)后)，可克服上述缺點(diǎn)?，F(xiàn)在 應(yīng)用很廣泛(7080%)。2 .液一固色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑(如 硅膠、氧化鋁等)。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作 用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是： 當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子(X)和溶 劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng) 爭(zhēng)吸附(未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中 心吸附的是S),可表示如下：Xm + nSa = Xa + nSm式中：Xm-流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa- 固定相中的溶劑分子；Xa-固定相中的溶質(zhì)分子；Sm-流動(dòng)相中的溶劑分子。當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：K=XaSm/XmSa式中：K為吸附平衡常數(shù)。討論：K

9、 越大，保留值越大。3 .離子交換色譜法 （Ion-exchange Chromatography）IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流 動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆 交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的 親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過(guò)程可 表示如下：X-（溶劑中）+ （ 樹(shù)脂-R4N+Cl-）=（樹(shù)脂-R4N+ X-） + Cl-（ 溶劑中）當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：KX=-R4N+X- Cl-/-R4N+Cl- X-分配系數(shù)為：DX=-R4N+ X-/X-= KX -R4N+Cl-/Cl-討論：DX與保留值的關(guān)系凡是在溶劑中能夠電離的物

10、質(zhì)通常都 可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。4 .離子對(duì)色譜法（Ion Pair Chromatography）離子對(duì)色譜法是將一種（或多種） 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子（稱(chēng)為對(duì)離 子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使 其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合 物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原 理可用下式表示：X+水相+ Y-水相=X+Y-有機(jī)相式中：X+水相-流動(dòng)相中待分離的有 機(jī)離子（也可是陽(yáng)離子）； Y-水相-流動(dòng) 相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁 基鉉、氫氧化十六烷基三甲鉉等） ；X+Y- 形成的離子對(duì)化合物。當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：KXY = X+Y-有機(jī)相 / X+水相Y- 水相根據(jù)定義，分配

11、系數(shù)為：DX= X+Y-有機(jī)相 / X+ 水相=KXY Y-水相討論：DX與保留值的關(guān)系離子對(duì)色譜法（特別是反相）發(fā)解決了 以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如 酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一 些生化試樣如核酸、核昔、生物堿以及藥 物等分離。5 .離子色譜法（Ion Chromatography）用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶 液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器， 為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo) 檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分 在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交 換色譜法相同。以陰離子交換樹(shù)脂 （R-OM作固定相, 分離陰離子（如 Br-）為例。當(dāng)待測(cè)陰離 子Br-隨流

12、動(dòng)相（NaOH進(jìn)入色譜柱時(shí)， 發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng) 的逆過(guò)程）：抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：R-H+ + Na+OH- = R-Na+ + H2O R-H+ + Na+Br- = R-Na+ + H+Br- 可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了 電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響； 試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸 H+Br-,可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。離子色譜法是溶液中陰離子分析的最 佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析。6 .空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)空間排阻色譜法以凝膠(gel) 為固定相。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的 孔徑比分子篩要大

13、得多，一般為數(shù)納米到 數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互 作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大 小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和 溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試 樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間 隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的 分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直 接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆 粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在 色譜圖上最后出現(xiàn)。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸 液系統(tǒng)、.分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處 理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與 特點(diǎn)。1 .進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣 間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)

14、樣量是恒定的。這對(duì) 提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2. 輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和 梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為 l . 474. 4X107Pa,流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng) 高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在 柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng) 速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持 樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯 存錯(cuò)和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣 品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、 離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有 一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲 得有效分離。3. 分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器 等。色譜柱

15、一般長(zhǎng)度為1050cm （需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管）， 內(nèi)徑為25mm由”優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻 璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑 為510卜m粒度的固定相（由基質(zhì)和固定 液構(gòu)成）.固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度 高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如 硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔 性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特 點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬（與氣相色 譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法 偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲 基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等） 或配體的有機(jī)化合物。因此，這類(lèi)固定相 對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集

16、素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白 分離出來(lái)。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá) 到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效 應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū) 內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分 辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì) 粒度小，塔板理論數(shù) N就越大。這也進(jìn)一 步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫 度從室溫調(diào)到60C,通過(guò)改善傳質(zhì)速度， 縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。4. 檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。（1）紫外檢測(cè)器該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見(jiàn)光） 有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)：

17、使用面 廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核昔酸、 多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢 測(cè)下限為10-10g/ml ）;線性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感；可檢測(cè)梯度溶液 洗脫的樣品。(2) 示差折光檢測(cè)器凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組 分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前,糖類(lèi)化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。 這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度 低(檢測(cè)下限為10-7g/ml ),流動(dòng)相的變 化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適 用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品 的檢測(cè)。(3) 熒光檢測(cè)器凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下， 其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正 比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具

18、有熒光 的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳炷、氨基酸、胺 類(lèi)、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測(cè)定，其 靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-1210-14g/ml ),痕量分析和梯度洗脫作品的 檢測(cè)均可米用。(5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、 制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。編輯本段操作注意要點(diǎn)1) .首先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾，根據(jù)需要選擇不同的濾膜，一般為有機(jī)系和水系，常用的孔徑為 0.20um和0.45um。2) .對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣 10-20分鐘。3) .正常情況下，儀器首先用甲醇沖 洗10-20分鐘，然后再進(jìn)入測(cè)試用流動(dòng)相(如流動(dòng)相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖 洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機(jī)相沖凈 為止)。4) . 一般情況下，流動(dòng)相沖洗20-30分鐘后，儀器方可穩(wěn)定，最重要的是儀器 基線走后，方可進(jìn)樣測(cè)試。5) .同時(shí)進(jìn)兩針標(biāo)樣， 將其結(jié)果相比 較，其結(jié)果的比值在 0.98-1.02 之間后， 就可以正式進(jìn)行樣品的測(cè)試了。6) .樣品測(cè)試結(jié)束后，就要進(jìn)行色譜儀及色譜