ITC等溫滴定量熱法的操作說明

1、等溫滴定量熱法等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)2011-10-13Page 22Isothermal Titration Calorimetry, ITC 等溫滴定量熱技術(shù)（ITC）是一種監(jiān)測(cè)由結(jié)合成分的添加而起始的任何化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù)，即用一種反應(yīng)物滴定另一種反應(yīng)物，隨著加入滴定劑的數(shù)量的變化，測(cè)量反應(yīng)體系溫度的變化 它通過高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息，它已經(jīng)成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法。 可獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)

2、，包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、摩爾結(jié)合焓（H）、摩爾結(jié)合熵（S）、摩爾恒壓熱容（Cp），和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如酶促反應(yīng)的Km和kcat）Page 33獨(dú)特特點(diǎn)：獨(dú)特特點(diǎn)： 它對(duì)被研究體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件，即具有非特異性的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)， 樣品用量小，方法靈敏度和精確度高(儀器最小可檢測(cè)熱功率2 nW，最小可檢測(cè)熱效應(yīng)0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，溫度范圍2 - 80 ，滴定池體積(1.43 ml)。 實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短(典型的ITC實(shí)驗(yàn)只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應(yīng)時(shí)間)， 操作簡(jiǎn)單(整個(gè)實(shí)驗(yàn)由計(jì)算機(jī)控制，使用者只需輸入實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，如溫度、注射次

3、數(shù)、注射量等，計(jì)算機(jī)就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù))。 測(cè)量時(shí)不需要制成透明清澈的溶液, 而且量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。 盡管微量熱法缺乏特異性但由于生物體系本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律，特別適應(yīng)于研究生物體系中的各種特異過程。Page 44Applications include:Characterization of molecular interactions of small moleculesLead optimization. Enzyme kinetics

4、. Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms. Assessment of biological activity. Page 55Page 66在恒溫下，注射器中的“配體”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。當(dāng)配體注射到池中，兩種物質(zhì)相互作用，釋放或吸收的熱量與結(jié)合量成正比。當(dāng)池中的高分子被配體飽和時(shí)，熱量信號(hào)減弱，直到只觀察到稀釋的背景熱量。Page 77ITC系統(tǒng)是通過細(xì)胞反饋網(wǎng)絡(luò) CFB來分別測(cè)量或者補(bǔ)償樣品和對(duì)照由于反應(yīng)所產(chǎn)生或者吸收的熱量。兩個(gè)硬幣狀的東西放置在絕熱的圓

5、筒中，通過那個(gè)細(xì)細(xì)的管子與外界聯(lián)通。有兩個(gè)熱量檢測(cè)裝置。一個(gè)用來檢測(cè)兩個(gè)樣品之間的熱量差，另一個(gè)檢測(cè)對(duì)照和環(huán)境的熱量差。當(dāng)樣品中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的時(shí)候，釋放或者吸收熱量，因此樣品和對(duì)照的溫度差會(huì)通過對(duì)樣品進(jìn)行增加或者減少熱量而穩(wěn)定在一個(gè)水平，就是baseline。因此那些用來維持T1=常數(shù)的熱量就被系統(tǒng)檢測(cè)畫作曲線。Page 88Page 99 滴定一般在盡可能接近絕熱的條件下進(jìn)行，被滴定物可以是液體或懸浮的固體；滴定劑可以是液體或氣體。溫度變化是由滴定劑與被滴定物間的化學(xué)作用或物理作用（例如一種有機(jī)分子吸附于固體表面）引起的。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以熱譜圖形式表示，它提供了有關(guān)反應(yīng)中物質(zhì)的量（滴定終點(diǎn)）和反

6、應(yīng)物質(zhì)的特性（焓變）的數(shù)據(jù)。對(duì)圖進(jìn)行分析，可以得知反應(yīng)容器中發(fā)生的反應(yīng)的類型和數(shù)目，以及溶液中存在的各物種的濃度等信息。這部分內(nèi)容稱為熱滴定，同時(shí)還可以確定反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，計(jì)算反應(yīng)的熱力學(xué)量,如平衡常數(shù)K(G)、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓變H和熵變S,這部分內(nèi)容稱為滴定量熱法。 測(cè)溫滴定法以熱效應(yīng)為基礎(chǔ),與溶液的許多性質(zhì)(如粘度、光學(xué)透明度、介電常數(shù)、溶劑強(qiáng)度、以及離子強(qiáng)度等)無關(guān),因此可以用于氣相、液相、非水溶液、有色溶液、膠體溶液和粘稠漿狀等體系。Page 1010典型的ITC數(shù)據(jù)配體溶液20次注射到ITC池的蛋白溶液中。每個(gè)注射峰（上圖）下方的區(qū)域與注射所釋放的總熱量相等。當(dāng)這種綜合的熱量相對(duì)添加到池中的配體摩爾比作圖時(shí)，就獲得了相互作用的完整結(jié)合等溫線（下圖）。用單位點(diǎn)模型來驗(yàn)證數(shù)據(jù)?；瘜W(xué)計(jì)量、結(jié)合常數(shù)及焓的數(shù)值都顯示在框內(nèi)。Page 1111Page 1212ITC法測(cè)量結(jié)合法測(cè)量結(jié)合/解離常數(shù)解離常數(shù) ITC可以直接測(cè)量焓變H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團(tuán)，因此測(cè)得的結(jié)果更加可信Page 1313Page 1414Page 1515（G）與總的結(jié)合親和力直接相關(guān)，但不能了解結(jié)合機(jī)理。ITC提供了（G）以及（H）和（S），產(chǎn)生了結(jié)合機(jī)理的真實(shí)圖像。作用機(jī)理研究與分析開發(fā)作用機(jī)理研究與分析開發(fā)Page 1616ITC：用生物相關(guān)模型系統(tǒng)架起橋梁：用生