熒光標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化棉花黃萎病菌及標(biāo)記菌系選育

1、熒光標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化棉花黃萎病菌及標(biāo)記菌系選育王曉楠袁齊宏袁張金鳳袁光楊其袁唐燦明*淵南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室袁江蘇南京210095冤摘要院為了研究黃萎病菌的侵染機(jī)制袁通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法袁將綠色熒光蛋白基因?qū)肼淙~型黃萎病菌VD07038袁將紅色熒光蛋白基因?qū)敕锹淙~型黃萎病菌Bp2中,分別獲得了具有綠色堯紅色熒光信號(hào)的陽性轉(zhuǎn)化子遙經(jīng)過分子驗(yàn)證和連續(xù)繼代培養(yǎng)袁證明了這些轉(zhuǎn)化子具有遺傳穩(wěn)定的對(duì)潮霉素的抗性遙通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)堯生長速度和致病力進(jìn)行檢測(cè)袁發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子與野生型基本一致袁少量轉(zhuǎn)化子發(fā)生變異袁其中轉(zhuǎn)化子Bp2R-30不能產(chǎn)生微菌核袁致病力顯著下降遙利

2、用熒光顯微鏡觀察了轉(zhuǎn)化子VD07038G-10在感病棉花品種蘇棉22幼苗根部的侵染情況遙結(jié)果表明袁在接菌12h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面曰接種79d后袁菌絲入侵到棉花根部的維管組織遙本研究獲得的熒光蛋白標(biāo)記的棉花黃萎病菌VD07038G-10可用于實(shí)時(shí)觀測(cè)黃萎病菌侵染棉花根系的過程袁并且可以定量鑒定不同棉花品種對(duì)該菌系的抗性袁為棉花黃萎病菌抗性鑒定提供一種新方法遙關(guān)鍵詞院棉花曰大麗輪枝菌曰綠色熒光蛋白曰紅色熒光蛋白曰轉(zhuǎn)化中圖分類號(hào)院S435.621文獻(xiàn)標(biāo)志碼院A文章編號(hào)院1002-7807淵2014冤03-0221-07WangXiaonan,QiHong,ZhangJinf

3、eng,GuangYangqi,TangCanming*(,210095,)Inordertoanalysetheinfectionmechanismof,encodinggreenfluorescentproteinwastransferredin-todefoliatingisolateVD07038andencodingredfluorescentproteinwastransferredintonon-defoliatingBp2via-mediatedtransformation.Finally,positivetransformantstaggedbygreenfluores-ce

4、ntproteinorredfluorescentproteinwereobtained.ThehygromycinBgeneticstabilityoftransgenicprogenieswastestedbyseriescultureandmolecularverification.Accordingtocolonymorphology,growthrateandpathogenicity,wefoundthattraitsofmostoftransformantsweresimilartothoseofwild-type,fewtransformantstendedtoformmuta

5、nts.TansformantsBp2R-30didnotproducemicrosclerotiaanditspathogenicitydecreasedsignificantly.UsingtheGFP-taggedVD07038G-10iso-late,colonizationofthefungusinrootsofthesusceptiblecottonSumian22wasinvestigated.Astheresultsshowedthat,12hoursafterinoculationviatherootdippingmethods,rootssurfaceofSumian22w

6、erecoveredwithconidia,7-9daysafterinocu-lation,hyphaefromtheleadingedgeofthecolonyprogressedacropetallyupthexylemvesselsofinfectedroots.VD07038G-10taggedbyfluorescentproteincanbeusedforobservationitsinfectionprocessinrealtimeoncottonrootsandi-dentificationofresistanceofdifferentcottonvarietiestothis

7、strain.Thisstudyprovideanewmethodforresistanceevaluationof.cotton;Kleb.;greenfluorescentprotein;redfluorescentprotein;transformation收稿日期院2013-11-22作者簡介院王曉楠淵1988-冤袁女袁碩士袁2011101118曰*通訊作者袁tangcm基金項(xiàng)目院高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金淵20120097110024冤曰國家自然科學(xué)基金(31071459)黃萎病對(duì)棉花的危害十分嚴(yán)重袁是影響棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的首要障礙遙我國棉花黃萎病是由土壤傳播的病原真菌大麗輪枝菌(K

8、leb.)引起的1遙大麗輪枝菌的寄主范圍非常廣泛袁可侵染600多種植物袁這些植物大部分屬于經(jīng)濟(jì)作物2-5遙番茄堯馬鈴薯堯黃瓜堯棉花堯煙草堯辣椒和茄子等都對(duì)其敏感袁而一般禾本科作物如水稻堯玉米和高粱等不受侵染袁且大麗輪枝菌的寄棉花學(xué)報(bào)CottonScience2014袁26淵3冤院221227棉花學(xué)報(bào)26卷主范圍還在逐漸擴(kuò)大6遙在沒有合適寄主的情況下袁黃萎病菌可以形成黑化的休眠結(jié)構(gòu)微菌核在土壤中長期存在袁防治難度很大7遙熒光蛋白具有穩(wěn)定堯直觀堯操作方便的熒光性質(zhì)和不需添加外源底物就可以在活細(xì)胞中直接檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)袁作為報(bào)告基因已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于絲狀真菌的研究中遙綠色熒光蛋白(Greenfluo-res

9、centprotein,GFP)于1962年由Shimomura等8首先從發(fā)光水母()中純化得到袁在真菌蛋白的亞細(xì)胞定位堯轉(zhuǎn)化子致病力檢測(cè)和與寄主植物互作方面表現(xiàn)出了較大的優(yōu)勢(shì)遙在真菌研究中常用的綠色熒光蛋白大多都經(jīng)過了修飾袁如sGFP和EGFP袁修飾后的蛋白賦予真菌菌絲更強(qiáng)的熒光水平袁并且對(duì)真菌的生長和致病力影響較小9-10遙Pliego等將轉(zhuǎn)入白紋羽菌獲得穩(wěn)定遺傳表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)化子袁Andrie等利用基因在從馬鈴薯中分離的大麗輪枝菌菌株中成功標(biāo)記了綠色熒光11-12遙1999年袁第一個(gè)紅色熒光蛋白drFP583淵DsRed冤被報(bào)道袁而后被應(yīng)用于植物和病原菌互作的研究13-14遙mCher

10、-ryRFP是由Shaner在紅色熒光蛋白DsRed的單體mRFP1的基礎(chǔ)上袁通過多輪隨機(jī)和定點(diǎn)突變得到15遙優(yōu)化后的mCherry比mRFP1熒光更亮袁成熟時(shí)間更短袁激發(fā)和發(fā)射波長更長袁分別為587nm和610nm遙因其諸多優(yōu)良性能袁mCherry備受研究人員的青睞遙本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將綠色熒光蛋白基因?qū)肼淙~型黃萎病菌VD07038袁將紅色熒光蛋白基因?qū)敕锹淙~型黃萎病菌Bp2袁分別獲得了能夠表達(dá)綠色熒光信號(hào)堯紅色熒光信號(hào)的陽性轉(zhuǎn)化子袁篩選到遺傳穩(wěn)定堯致病力與野生型一致的轉(zhuǎn)化子袁可用于研究黃萎病菌以及黃萎病菌和棉花之間的互作關(guān)系遙材料和方法本實(shí)驗(yàn)于20112012年在南京農(nóng)業(yè)大

11、學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成遙試驗(yàn)材料遙本試驗(yàn)所用棉花品種為感黃萎病的陸地棉品種蘇棉22袁用于轉(zhuǎn)化子致病力檢測(cè)遙遙落葉型黃萎病菌菌系VD07038由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所朱荷琴提供袁非落葉型菌系Bp2由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所林玲提供遙遺傳轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌淵冤菌株為EHA105遙攜帶有和基因的質(zhì)粒PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建遙和基因以及抗性選擇標(biāo)記基因潮霉素B基因都受構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子gpd調(diào)控遙試驗(yàn)方法遙分別將2種黃萎病菌接種在含0堯25堯50堯75和100滋g窯mL-1潮霉素B的PDA平板上檢測(cè)其生長情況袁確定了野

12、生型黃萎病菌VD07038和Bp2對(duì)潮霉素B的耐受濃度都為50滋g窯mL-1遙參照Maruthachalam等16提出的方案進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)化袁所得到的陽性轉(zhuǎn)化子按照梯度稀釋的方法袁進(jìn)行連續(xù)2次的單孢分離袁獲得單孢純化菌株遙遙采用CTAB法提取菌株DNA袁對(duì)潮霉素B抗性基因(Hyg-4F:TCGTTATGTTTATCGGCACTTT;Hyg-5R:GATGTTGGCGACCTCGTATT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增袁產(chǎn)物用1%的凝膠電泳進(jìn)行鑒定遙將轉(zhuǎn)化子接種到不加抗生素的PDA培養(yǎng)基上傳代5次袁再轉(zhuǎn)接到含50滋g窯mL-1潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上生長袁用熒光顯微鏡淵Nikon袁日本冤觀察其熒

13、光表達(dá)情況遙遙用直徑0.7cm的打孔器在平板上黃萎病菌的菌絲生長最邊緣的地方取大小相同的菌餅袁接種到PDA平板中央袁置于25恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)袁每隔1d用直尺測(cè)量菌落的直徑袁觀察菌落生長速度及菌落形態(tài)袁連續(xù)觀察18d遙將0.7cm的菌餅一塊接種于100mL液體培養(yǎng)基中袁25堯150r窯min-1震蕩培養(yǎng)袁每天測(cè)定其產(chǎn)孢量袁連續(xù)測(cè)定7d遙以野生型菌株VD07038和Bp2為對(duì)照袁實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次遙遙將直徑0.7cm菌餅接種于含0.5%淵質(zhì)量濃度冤羧甲基纖維素和果膠的Czapek培養(yǎng)基平板上袁25恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)572223期d遙在平板上加入約20mL0.1%的剛果紅染色30min袁水洗2次袁再用20mL濃

14、度為1mol窯L-1的NaCl脫色2次袁每次約20min遙以野生型菌株為對(duì)照袁通過比較菌落周圍透明圈的有無或大小判斷突變體菌株間胞外酶產(chǎn)生的差異遙遙在蘇棉22植株的12片真葉期袁將各轉(zhuǎn)化子的孢子濃度調(diào)整到1.0伊106mL-1袁取10mL孢子懸浮液接種于棉花根部遙分別以野生型菌株VD07038堯Bp2和無菌水作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照袁在接菌后的第2堯3堯4和5周袁調(diào)查病情并計(jì)算病情指數(shù)袁參照Huang等的方法17進(jìn)行遙實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次遙遙將VD07038G-10轉(zhuǎn)化子接種于PDA液體中袁25堯150r窯min-1震蕩培養(yǎng)45d袁雙層滅菌紗布過濾菌液袁用無菌水稀釋到4伊106mL-1遙待棉花子葉展平時(shí)

15、袁在無菌的條件下將棉株連根拔起遙將根在無菌水中沖洗干凈袁然后置于VD07038G-10的孢子懸浮液中浸泡5min遙將接菌后的幼苗轉(zhuǎn)移到新滅菌的蛭石中袁置于25光照培養(yǎng)箱中袁并與接種后12h堯3d堯5d堯7d堯9d和14d取樣袁觀察VD07038G-10在蘇棉22根部的侵染情況遙結(jié)果與分析黃萎病菌的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性分析通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法袁分別將PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP這兩個(gè)載體的T-DNA區(qū)導(dǎo)入野生型黃萎病菌菌株VD07038和Bp2袁獲得帶綠色熒光蛋白淵sGFP冤標(biāo)記的VD07038轉(zhuǎn)化子及紅色熒光蛋白淵mCherryRFP冤標(biāo)記的Bp2轉(zhuǎn)化子遙挑取少量菌

16、絲制片袁利用熒光顯微鏡分別在藍(lán)光堯綠光和可見光模式下對(duì)所有陽性轉(zhuǎn)化子的熒光表達(dá)情況進(jìn)行觀察袁發(fā)現(xiàn)所有陽性轉(zhuǎn)化子袁無論其處于孢子階段還是菌絲階段袁均能產(chǎn)生綠色熒光或紅色熒光淵圖1c袁d冤袁但不同轉(zhuǎn)化子間熒光信號(hào)強(qiáng)弱不一袁而野生型菌株不能產(chǎn)生熒光遙這表明2種熒光蛋白被成功導(dǎo)入野生型黃萎病菌袁并且在黃萎病菌的各個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中均能表達(dá)遙其中VD07038G-10堯VD07038G-9堯Bp2R-17和Bp2R-30等轉(zhuǎn)化子能夠呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)遙將4個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到不加抗生素的PDA培養(yǎng)基上分別傳代5次袁再轉(zhuǎn)接到含50滋g窯mL-1潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上袁發(fā)現(xiàn)4個(gè)轉(zhuǎn)化子都能生長并且均能產(chǎn)生熒光袁表明和基

17、因分別穩(wěn)定地插入了野生型VD07038和Bp2菌株的基因組中遙轉(zhuǎn)化子的分子檢測(cè)以野生型黃萎病菌VD07038和Bp2及4個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板袁利用基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增袁攜帶有和基因的質(zhì)粒PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP作為陽性對(duì)照袁無菌水作為陰性對(duì)照遙電泳檢測(cè)結(jié)果顯示所有的轉(zhuǎn)化子中均可以擴(kuò)增出約500bp的目的片段袁而野生型菌株未能擴(kuò)出淵圖2冤袁從而進(jìn)一步證明PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP這兩個(gè)載體的T-DNA區(qū)已被成功導(dǎo)入野生型黃萎病菌遙轉(zhuǎn)化子致病力相關(guān)性狀分析遙野生型菌株VD07038和Bp2在PDA培養(yǎng)基上袁25恒溫培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)菌落中部菌絲質(zhì)

18、地致密袁菌絲白色袁生長旺盛袁正面和背面都有黑色素和微菌核遙對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察袁發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)與野生型菌株基本一致袁而有些轉(zhuǎn)化子的形態(tài)發(fā)生了較大變化袁表現(xiàn)為微菌核產(chǎn)生量下降袁只在菌落中間極小的部位產(chǎn)生黑色素或者不產(chǎn)生微菌核袁如院Bp2R-30遙遙以野生型菌株為對(duì)照袁對(duì)轉(zhuǎn)化子的生長速度堯產(chǎn)孢量進(jìn)行考察遙發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上袁所有轉(zhuǎn)化子的生長速度都略低于野生型菌株袁其中Bp2R-30的生長速度顯著低于野生型菌株Bp2淵圖3冤遙產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果表明袁大部分轉(zhuǎn)化子與野生型相差不大袁含基因的轉(zhuǎn)化子VD07038G-10堯VD07038G-9與野生型一致袁都是在接種后4d出現(xiàn)產(chǎn)孢高峰

19、期遙含基因的轉(zhuǎn)化子Bp2R-17與野生型Bp2一致袁在接種后6d出現(xiàn)產(chǎn)孢高峰期曰而轉(zhuǎn)化子Bp2R-30產(chǎn)孢量顯著低于野生型Bp2袁且產(chǎn)孢高峰出現(xiàn)在接種后4d袁比野生型提前2d淵表1冤遙王曉楠等院熒光標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化棉花黃萎病菌及標(biāo)記菌系選育223棉花學(xué)報(bào)26卷a院白光下轉(zhuǎn)化子VD07038G-10的菌絲和孢子囊曰b院藍(lán)光下轉(zhuǎn)化子VD07038G-10菌絲和孢子囊綠色熒光的表達(dá)曰c院白光下轉(zhuǎn)化子Bp2R-17的菌絲和孢子囊曰d院綠光下轉(zhuǎn)化子Bp2R-17菌絲和孢子囊紅色熒光表達(dá)曰e院接種12h后袁轉(zhuǎn)化子VD07038G-10孢子在蘇棉22根部的吸附情況曰f院接種5d后袁轉(zhuǎn)化子VD07038G-10的

20、孢子在皮層中的擴(kuò)展情況遙a院HyphaandsporangiumofVD07038G-10underbrightfield曰b院ExpressionofinhyphaandsporangiumofVD07038G-10underbluelight曰c院HyphaandsporangiumofBp2R-17underbrightfield曰d院Expressionofinhy-phaandsporangiumofBp2R-17undergreenlight曰e院12hoursafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10lyingontherootsur-faceof

21、Sumian22曰f院5daysafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10extendedinthecortex.圖1轉(zhuǎn)化子VD07038G-10和Bp2R-17菌株的熒光表達(dá)Fig.1ExpressionoffluorescentproteinintransformantsVD07038G-10andBp2R-17遙通過對(duì)轉(zhuǎn)化子胞外分泌纖維素酶和果膠酶的能力進(jìn)行檢測(cè)袁發(fā)現(xiàn)4個(gè)轉(zhuǎn)化子胞外分泌酶的產(chǎn)生和利用情況與野生型基本一致遙轉(zhuǎn)化子致病力檢測(cè)通過灌根的方法檢測(cè)4個(gè)轉(zhuǎn)化子VD07038G-10堯VD07038G-9堯Bp2R-17堯Bp2R-30對(duì)感黃萎病菌的棉花

22、品種蘇棉22的致病情況袁1院PCL-sGFP質(zhì)粒曰2院轉(zhuǎn)化子VD07038G-10曰3院VD07038G-9曰4院VD07038-WT曰5院Bp2R-17曰6院Bp2R-30曰7院Bp2-WT曰8院PCL-mCherryRFP質(zhì)粒曰H院無菌水曰M院2000bpMarker遙1:PlasmidPCL-sGFP;2:TransformantVD07038G-10;3:TransformantVD07038G-9;4:WildtypeVD07038;5:Trans-formantBp2R-17;6:TransformantBp2R-30;7:WildtypeBp2;8:PlasmidPCL-mChe

23、rryRFP;H:Sterilewater;M:2000bpMarker.圖2轉(zhuǎn)化子中潮霉素基因的PCR檢測(cè)Fig.2DNAamplificationwiththeprimersspecificforgenesfromtransformants2243期表1轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量考察Table1Sporulationquantityoftransformants圖3轉(zhuǎn)化子的生長速率檢測(cè)Fig.3Thegrowthrateoftransformants發(fā)現(xiàn)落葉型黃萎病菌VD07038及其轉(zhuǎn)化子的致病能力要顯著高于非落葉型黃萎病菌Bp2及其轉(zhuǎn)化子遙含基因的轉(zhuǎn)化子VD07038G-10堯VD07038G-9

24、及含基因的轉(zhuǎn)化子Bp2R-17致病力與野生型菌株基本一致袁都可以使棉花產(chǎn)生嚴(yán)重的壞死袁葉片萎蔫袁根部變褐袁而轉(zhuǎn)化子Bp2R-30的致病力明顯下降淵表2冤遙GFP標(biāo)記的黃萎病菌的侵染使用濃度為4伊106mL-1的VD07038G-10的孢子懸浮液對(duì)蘇棉22進(jìn)行蘸根處理袁接種12h后觀察到VD07038G-10的孢子可以吸附在根部的任何位置袁且孢子隨機(jī)分布袁但不同部位的孢子量有多有少淵圖1e冤遙接種3d后袁棉花根部表面出現(xiàn)復(fù)雜的菌絲網(wǎng)絡(luò)袁覆蓋在主根上袁接著孢子萌發(fā)進(jìn)入根內(nèi)部遙接種5d后袁可以觀察到棉花黃萎病菌的孢子在根的皮層內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)展(圖1f)袁此時(shí)60%的蘇棉22的根部都出現(xiàn)褐色的病癥遙接種79

25、d后袁菌絲開始入侵到棉花主根部的維管組織遙接菌14d后袁75%的蘇棉22的根部出現(xiàn)黑色的病斑袁葉片出現(xiàn)萎蔫堯枯黃的癥狀遙注院同一列中a,b,c表示處理間在0.05水平上的差異顯著遙Note:Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.菌株Strains產(chǎn)孢量Sporulationquantity(伊106)1d2d3d4d5d6d7dVD07038-WT2.73依0.45b160.33依1.49a304.33依5.67a366.33依28.92a336.67依10.14a332.66依18.22a357.66依4.33aVD07038G-102.61依0.51

26、b192.00依2.64a289.60依14.24a354.66依21.31a328.67依14.85a320.33依18.94ab356.00依2.08aVD07038G-92.67依0.41b175.86依1.25a306.70依9.42a359.16依4.41a332.80依12.5a326.30依5.2ab356.70依1.12aBp2-WT4.00依0.29a62.00依0.29b198.66依0.67b252.00依3.06b287.66依10.27b303.66依2.33ab261.33依9.27bBp2R-173.60依0.33ab57.33依0.33b206.66依3.31b

27、246.00依4.93b271.66依1.67b293.66依6.98b254.33依2.96bBp2R-301.17依0.17c8.50依0.29c76.67依1.67c83.33依1.67c76.67依1.67c75.83依2.20c55.00依1.44c表2野生型及轉(zhuǎn)化子的致病力調(diào)查Table2Pathogenicitytestofwildtypeandtransformants注院同一列中a,b,c表示處理間在0.05水平上的差異顯著遙Note:Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.菌株Strains病情指數(shù)Diseaseindex2周Twowe

28、eks3周Threeweeks4周Fourweeks5周FiveweeksVD07038-WT11.25a22.50a43.75a51.25aVD07038G-1010.00a20.00a45.00a51.25aVD07038G-98.75ab18.75ab43.75a50.00aBp2-WT5.00b15.00b35.00b40.00bBp2R-175.00b15.00b33.75b42.50bBp2R-300.00c3.75c21.25c26.67c王曉楠等院熒光標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化棉花黃萎病菌及標(biāo)記菌系選育225棉花學(xué)報(bào)26卷討論農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化由于具有受體材料范圍廣堯轉(zhuǎn)化效率高堯轉(zhuǎn)化子能夠

29、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的研究遙2004年Dobinson等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的定點(diǎn)突變的方法得到了大麗輪枝菌1(胰蛋白酶)基因的突變體袁證明了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法可以用于大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化和基因定點(diǎn)突變18遙Eynck等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pGV04載體成功地轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌袁獲得了穩(wěn)定表達(dá)GFP的大量轉(zhuǎn)化子19遙本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將綠色熒光蛋白基因?qū)肼淙~型黃萎病菌VD07038袁將紅色熒光蛋白基因非落葉型黃萎病菌導(dǎo)入Bp2袁成功獲得了攜帶有相應(yīng)熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)化子遙本研究進(jìn)一步說明這種轉(zhuǎn)化方法是有效的遙研究表明T-DNA整合到黃萎病菌基因組上時(shí)袁其插入位點(diǎn)是隨機(jī)的袁

30、而插入位點(diǎn)的不同可能會(huì)影響轉(zhuǎn)化子的生長速度堯菌落形態(tài)和菌落顏色堯微菌核產(chǎn)生等性狀16,20遙對(duì)所有轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察袁發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)異常袁產(chǎn)微菌核能力下降甚至不能產(chǎn)生微菌核遙黃萎病菌的微菌核是由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大堯胞壁增厚并多向芽殖而形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)袁可以在沒有寄主存在的條件下在土壤中存活20年以上遙已經(jīng)證明稻瘟病微菌核與致病力存在一定關(guān)系21-22遙本研究中的轉(zhuǎn)化子Bp2R-30產(chǎn)微菌核能力消失袁與野生型菌株相比致病力顯著下降袁從而說明棉花黃萎病菌的致病力與微菌核的產(chǎn)生可能存在一定程度正相關(guān)性袁這與田秀明23堯徐榮旗等24的研究是一致的遙通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的生長速度和產(chǎn)孢量進(jìn)行

31、考察袁發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子生長速度和產(chǎn)孢量與野生型基本一致袁少量轉(zhuǎn)化子發(fā)生變異袁生長速度下降袁產(chǎn)孢量高于或低于初始菌株袁并且與野生型相比產(chǎn)孢高峰提早或推遲遙這些表型的變異很可能是由T-DNA的插入破壞基因表達(dá)所導(dǎo)致的遙因此袁這些突變體是后期研究黃萎病菌基因功能的寶貴材料遙本研究表明通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可以將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花黃萎病菌袁并且篩選出了帶有熒光標(biāo)記而致病力與野生型菌株無差異的轉(zhuǎn)基因菌株遙這些菌株可以用于棉花對(duì)黃萎病的抗性鑒定遙棉花品種對(duì)黃萎病的抗性鑒定通常在人工接種的病圃或自然病圃進(jìn)行袁根據(jù)發(fā)病率和病指確定品種的抗性水平遙人工病圃或自然發(fā)病田塊誘發(fā)篩選抗病或耐病的品種資源袁都需要一個(gè)適宜發(fā)

32、病的環(huán)境條件和發(fā)病過程袁因此抗性鑒定結(jié)果易受到天氣及土壤條件的影響袁導(dǎo)致年份堯地區(qū)間鑒定結(jié)果的差異袁也難以觀察病菌的侵染過程遙研究更為準(zhǔn)確的鑒定方法很有必要遙VD07038菌系是國家棉花區(qū)域試驗(yàn)中進(jìn)行黃萎病抗性鑒定采用的菌系袁作者將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入VD07038菌系袁并利用標(biāo)記的VD07038G-10轉(zhuǎn)化子袁觀察了黃萎病菌對(duì)感病品種蘇棉22的侵染袁發(fā)現(xiàn)接菌12h后VD07038G-10的孢子隨機(jī)分布在根表面曰接種79d后袁菌絲開始入侵到棉花主根部的維管組織曰接菌14d后袁出現(xiàn)根部變褐袁葉片萎蔫堯枯黃的癥狀曰上述結(jié)果與Val-lad等25和Zhang等26的研究一致遙說明所獲得的轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基

33、因的VD07038菌系可以用于實(shí)時(shí)觀測(cè)黃萎病菌侵染棉花根系的動(dòng)態(tài)過程袁并且可以定量鑒定不同棉花品種對(duì)該菌系的抗性袁根據(jù)熒光強(qiáng)度確定抗性水平袁使抗性鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確遙本研究結(jié)果為棉花黃萎病抗性鑒定提供了一種新的方法遙致謝院感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所朱荷琴研究員為本實(shí)驗(yàn)提供了落葉型黃萎病菌菌系VD07038袁感謝江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所林玲研究員提供非落葉型菌系Bp2遙參考文獻(xiàn)院1KlostermanSJ,AtallahZK,ValladGE,etal.Diversity,pathogenicity,andmanagementofspeciesJ.Annu-alReviewofPhytopa

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