小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的制備與測(cè)定精品資料

1、小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的制備與測(cè)定摘要：過(guò) 氧化氫酶 (Catalase)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原酶，是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶尤其在動(dòng)物的肝臟、腎臟、 紅細(xì)胞中含量較多， 其生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi) H2O2分解，防止過(guò)多 H2O2 對(duì)細(xì)胞的危害。人工制備的過(guò)氧化氫酶可廣泛應(yīng)用于食品與乳制品業(yè)，造紙與印染業(yè)，農(nóng)業(yè)與環(huán)保業(yè)， 以及醫(yī)療衛(wèi)生業(yè)等多領(lǐng)域。過(guò)氧化氫酶分子量約為 238KD，結(jié)構(gòu)上由 4 個(gè)具有相同多肽鏈的亞基組成，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，在 407nm波長(zhǎng)下有特征性的吸收。溶于水 , 幾乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有機(jī)試劑， 酸性環(huán)境下溶解度低易析出， 最適溫度為 37，最適 pH

2、值約為 7.8 。 本實(shí)驗(yàn)以小鼠肝臟為原料，根據(jù)過(guò)氧化氫酶溶解性和大分子等特性，通過(guò)組織勻漿、鹽析、透析、分子篩層析等步驟，提取純化過(guò)氧化氫酶。建立了一套適合一般實(shí)驗(yàn)室分離純化過(guò)氧化氫酶的方法，并對(duì)制備的過(guò)氧化氫酶進(jìn)行蛋白濃度、分子量、米氏常數(shù)等測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)告如下：一、實(shí)驗(yàn)器材1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性小鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）2、主要器材：托盤天平，組織搗碎機(jī)，離心管，H2050R 高速冷凍離心機(jī)，CU600 型電熱恒溫水箱， DYY-8L 型電泳儀（北京市六一儀器廠） ， H2S-H 水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司） ，垂直板型電泳裝置，制冰機(jī)， 4冰箱二、實(shí)驗(yàn)方法1、過(guò)

3、氧化氫酶制備勻漿鹽析過(guò)氧化氫酶制備透析層析勻漿是根據(jù)過(guò)氧化氫酶的性質(zhì)，利用有機(jī)溶劑將組織細(xì)胞搗碎，使其釋放出的方法。小鼠肝臟勻漿液制備：用頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟，稱重6g ；按來(lái)1：8.5 的比例加入勻漿緩沖液 51ml（0.05mol/L 醋酸 -23.5%乙醇緩沖液， pH4.0）,勻漿機(jī)搗碎 3-5min ；緩慢滴加勻漿液體積 0.5 倍的氯仿（邊加邊快速攪拌）再次勻漿 1min；勻漿液離心（ 4, 6500rpm, 30min）后保留上清液備用。鹽析是在過(guò)氧化氫酶中加入適當(dāng)濃度的中性鹽溶液，破壞其水化膜， 使其成鹽析狀態(tài)而沉淀下來(lái)，離心后可除去部分雜蛋白。鹽析法粗提過(guò)氧化氫酶：

4、緩慢加入上清液體積0.06 倍的 0.5mol/L 的硫酸鈉溶液，冰浴攪拌1h，離心（ 4, 6500rpm, 10min），保留離心沉淀；加入4 倍肝重（ 0.1mol /L pH7.8）的磷酸緩沖液手動(dòng)玻璃勻漿器使沉淀溶解 , 離心（ 4, 4000rpm, 10min ） , 保留上清備用。透析是利用透析袋的半透過(guò)性， 在一定透析條件下， 使過(guò)氧化氫酶以不變性的沉淀形式析出，復(fù)溶后，可除去部分雜蛋白。透析法純化過(guò)氧化氫酶：將上清液置于透析袋，透析兩周（透析液： 20%乙醇， 0.1mol/L pH4.7 醋酸緩沖液， 0.1mol/L 氯化鈉）中途更換一次透析液；透析后取出濁溶液，離心（

5、 4 , 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于 0.1mol/L pH7.8 磷酸緩沖液中 , 離心（ 4 ,4500rpm, 10min ）收獲上清，得到小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶溶液。將收獲的上清液（ 3 組合并為一組）放入處理過(guò)的透析袋中，置于 50% 的甘油中包埋濃縮 24 小時(shí)后放冰箱保存，制備過(guò)程中各階段產(chǎn)物用比色測(cè)定法測(cè)定酶活， 分析制備效率。 分離純化產(chǎn)物酶活性回收率用各步產(chǎn)物的酶活占勻漿上清液酶活的百分比來(lái)表示。層析是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小不同，在凝膠層柱的擴(kuò)散移動(dòng)速度不同使混合物分離的方法。分別在 280nm和 407nm波長(zhǎng)下測(cè)光吸收值，合并收集峰值重合管，得到純化

6、過(guò)的過(guò)氧化氫酶。取出裝柱好的層析柱，打開出口使緩沖液緩緩流出，當(dāng)液面與凝膠床面平齊時(shí)，沿柱口旋轉(zhuǎn)加樣，同時(shí)開始收集層析柱的流出液，每管收集約 25 滴，一次在 407nm和 280nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管吸光度值。并繪制曲線。2、過(guò)氧化氫酶的性質(zhì)測(cè)定純度及分子量測(cè)定 (SDS-PAGE)過(guò)氧化氫酶測(cè)定蛋白含量測(cè)定 (lowry法)米氏常數(shù)值測(cè)定(Lineweaver - Burk雙倒數(shù)作圖法 )電泳電泳是根據(jù)帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著預(yù)期與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，蛋白質(zhì)電泳遷移率主要取決于它的相對(duì)分子量。 所以用電泳法可測(cè)定過(guò)氧化氫酶的分子量。用定量移液器把樣品和 MAKER加在配好的 SDS-

7、聚丙烯酰胺凝膠垂直板的樣品槽內(nèi)，接上電源開始電泳 （ 55min），取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán) R-250 染色 15min；脫色后放置一周后觀察蛋白質(zhì)條帶情況，并計(jì)算相對(duì)遷移率lowry 法測(cè)定純化的過(guò)氧化氫酶濃度是根據(jù)蛋白質(zhì)中的酪氨酸與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產(chǎn)生藍(lán)色化合物，其顏色深淺與蛋白含量成正比的方法。作出標(biāo)準(zhǔn)曲線的到過(guò)氧化氫酶的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白的選擇：選擇與待測(cè)樣品相同組成的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制： 將標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng)凱式定氮法準(zhǔn)確測(cè)定其蛋白含量， 再用無(wú)離子水配成 0.1mgmL儲(chǔ)存液。按照表（如下）配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白組， 編上號(hào)碼，以第一管為空白管，在分光度計(jì)上

8、測(cè)定 650mn處的光密度值。以各標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，各管密度值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。米式常數(shù)值測(cè)定滴定法：以 H2O2 為底物，用過(guò)氧化氫酶催化其分解 10min，加入硫酸終止催化反應(yīng)，并用已知濃度高錳酸鉀滴定剩余的 H2O2，換算出減少的 H2O2的量，進(jìn)而計(jì)算出酶的活力。在 Km值測(cè)定中采用此法測(cè)定酶活力。過(guò)氧化氫酶活力單位定義為：以每分鐘催化1molH2O2減少所需的過(guò)氧化氫酶的量作為一個(gè)酶活性單位 （U）。樣品的比活以每毫克樣品蛋白所含的酶活性單位數(shù)表示。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果層析后蛋白吸光度變化曲線圖波長(zhǎng)吸光試度管序號(hào)161718407nm280nm0.0930.1580.1080.1890.1350.234190.4750.264200.1520.222210.1710.210220.1700.194圖如下：SDS-PAGE測(cè)定過(guò)氧化氫酶分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量樣品遷移距BPB的遷移LgMrRf離(cm)距離 (cm)A974004.990.40.084B662004.820.70.148C427004.631.40.2964.73D310004.492.00.422E