中科大FPLC使用參考

1、FPLC使用指南From : USTC | Date : 2016-12-01簡(jiǎn)介(INTRODUCTIONFPLC全稱(chēng)為快速蛋白液相色譜 (Fast protein liquid chromatography )，其原理與高效液相色譜理論類(lèi)似，是由經(jīng)典的液體柱層析引入氣相色譜理論，并且對(duì)相 體進(jìn)行了改革，配用高壓輸液泵，采用高靈敏檢測(cè)器、梯度洗脫裝置、自動(dòng)收 集裝置和微機(jī)等發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代液相色譜。我們實(shí)驗(yàn)室有兩套純化儀，一臺(tái)是AKTA prime plus(著重介紹)，另外一臺(tái)是 AKTA pure protein(簡(jiǎn)單介紹)。AKTA Pure 純化系統(tǒng)(詳見(jiàn) AKTA Pure onsi

2、te-training)AKTA Prime Plus 純化系統(tǒng)?安全(Safety)?組件(Components)?方法編程(Method programming)?使用方法(Usage)?維護(hù)注意事項(xiàng)(Maintenance)安全(Safety)1. 警告！系統(tǒng)必須與接地電源插座連接。2. 警告！用戶不能打開(kāi)系統(tǒng)，因?yàn)橄到y(tǒng)含高壓電路，會(huì)造成致命的電擊。3. 警告！必須總有上樣環(huán)連接在上樣閥的接口2和6。這是為了在轉(zhuǎn)換此閥時(shí)防止液體從這些接口噴出。尤其是使用危險(xiǎn)化學(xué)品時(shí)，這是特 別危險(xiǎn)的。4. 警告！如果有大量溢出的液體滲入系統(tǒng)外殼并同帶電部件接觸的危險(xiǎn)，應(yīng)立即關(guān)閉系統(tǒng)并同指定的技術(shù)服務(wù)人員

3、聯(lián)系。5. 警告！ NaOH有害健康，應(yīng)避免泄漏。組件(Components)AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)包括下列部件：1. 緩沖液閥和梯度轉(zhuǎn)換閥 (Buffer valve and gradie nt switch valve) 緩沖液閥用于 選擇使用緩沖溶液，用于系統(tǒng)泵施加大的樣品體積。梯度轉(zhuǎn)換閥用于建立梯度。2. 系統(tǒng)泵(System pump)：系統(tǒng)泵用于經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)送液體，如樣品或緩沖溶液。將液體經(jīng)緩沖液閥、梯度轉(zhuǎn)換閥或經(jīng)上樣閥進(jìn)入流動(dòng)通道。3. 壓力傳感器(Pressure sensor)壓力傳感器可以測(cè)量在位液體壓力。還可用作 壓力保護(hù)裝置。4. 混合器(Mixer)

4、:混合器用于混合兩元梯度。以兩步將溶液混合以得到最適宜 的結(jié)果?；旌掀鞯捏w積可以選擇。5. 上樣閥(Injection valve)：上樣閥用于裝加樣環(huán)和用于將樣品注射到柱上。6. 檢測(cè)器(Monitor):檢測(cè)器的目的是測(cè)量流出柱后液體的UV吸收、電導(dǎo)率和pH (任選)。用于這些測(cè)量的流動(dòng)池安裝在系統(tǒng)的右側(cè)。7. 具有分流閥的分部收集器 (Fraction collector with flow diversion valve):分部收集器用于將樣品組分收集在管中供進(jìn)一步分析。分流閥在廢液和收集管之間轉(zhuǎn)換 流向。? 方法編程(Method programming)主菜單概要該菜單出現(xiàn)在自檢后

5、啟動(dòng)時(shí)，用于運(yùn)行予制的應(yīng)用Template模板和法模板。Run stored Method用于運(yùn)行用戶編輯的運(yùn)行方法Man ual Run用于不使用方法，手工運(yùn)行系統(tǒng)。Program Method用于編輯用戶專(zhuān)用方法。用于對(duì)檢測(cè)紫外(UV)、電導(dǎo)、pH、溫度、和運(yùn)轉(zhuǎn)泵Set Parameters及混合器設(shè)置參數(shù)。用于檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)部參數(shù)，例如序列號(hào)、泵運(yùn)行時(shí)間、Check和燈亮度。使用方法（Usage）利用AKTA Prime Plus洗脫鎳柱中的蛋白（以5 mL鎳柱為例）1. 打開(kāi)AKTA （機(jī)器背部左下角），將 A泵和B泵用蒸餾水沖洗干凈分別插入到 Ni-binding buffer 和 El

6、ution buffer 中 ，并在 Template 中選擇 system wash, 洗泵（大概五分鐘）。2. system wash完畢后，先選擇 manual run，%B=Q pressure limitation= MPa，流速=1 ml/min。先將Ni柱底部接到探測(cè)器上，再將1號(hào)接線口接到鎳柱上 端（這樣可以防止綠色線管扭曲），觀察電腦屏幕待 UV線、電導(dǎo)線平齊時(shí)End program。3. 設(shè)定程序：流速 3 ml/min， limit pressure 為 MPa設(shè)定 breakpoint:0 ml： %B=4, set fraction size=020 ml:開(kāi)始拉梯度

7、，%B=4 開(kāi)始收集樣品，set fraction size 3 ml/tube80 ml： %B=60 同時(shí)也一直在收集樣品，set fraction size 3 ml/tube100 ml： %B=60（有時(shí)有些蛋白量很大或者延時(shí)出來(lái)，可以設(shè)這個(gè)程序，以防萬(wàn)一），set fraction size 3 ml/tubeEnd4. 蛋白純化結(jié)束后，要清洗 AKTA泵內(nèi)部溶液，方便下位同學(xué)使用，將 A泵和B泵用蒸餾水沖洗干凈插入到蒸餾水中，并在Template中選擇systemwash,洗A、B泵。用蒸餾水清洗完畢后如果長(zhǎng)期不用機(jī)器，需要用20%酒精再次清洗系統(tǒng)泵。并將收集器上的玻璃管收拾干凈

8、，并用水清洗，放于管架晾干。（總之，意思就是：0 ml時(shí)所有的系統(tǒng)全部要求置零，0-20 ml區(qū)間跑4% elutionbuffer把雜蛋白洗下來(lái)。20-80 ml區(qū)間設(shè)定elution buffer的濃度從4%慢慢升 到60%同時(shí)收集樣品，80-100 ml區(qū)間用60%把剩余蛋白全部洗脫下來(lái)并收集 樣品，到達(dá)100 ml時(shí)停止。）5. 蛋白質(zhì)純化圖譜的保存與提?。?）保存：在電腦桌面打開(kāi) prime view evaluation軟件，打來(lái)文件夾，在里面按照時(shí)間順序找到你蛋白質(zhì)純化圖譜， 然后點(diǎn)擊file，選擇save as將你的圖保存在你的文件夾。（2）提?。狐c(diǎn)擊file,選擇 expor

9、t curves 選擇 01: UV 和 06： Cone并在 Reduce numberof samples中選擇Reduce by 1。點(diǎn)擊保存，得到excel表格，并用 Graphpad prism5做蛋白純化圖譜。關(guān)鍵步驟：1. 提前看好轉(zhuǎn)盤(pán)與滴液體的部分是否靠緊，否則不會(huì)自動(dòng)收集樣品。2. 根據(jù)出來(lái)的峰對(duì)應(yīng)的離心管取下來(lái)放在冰上，取60卩至ml Ep管，暫放在冰上，用于制備SDS-PAG樣品。3. 根據(jù)峰的位置選擇樣品，一般會(huì)有 30 ml左右，加入1 mM EDTA和 2 mMDTT以及 PMSF,下面的 gel filtration 可以用 super loop 上樣。4. 萬(wàn)一

10、電腦顯示器上不更新圖譜了，可能是與電腦的連接斷了，需要關(guān)了純 化儀，重啟。5. 樣品收集器偶爾會(huì)出現(xiàn)跳管子的情況，受樣品是要注意從頭或從尾對(duì)一下管子。跑其他柱子也是一 樣。6. 不要用蠻力擺動(dòng)輸送臂。松開(kāi)固定輸送臂按紐,并將臂升高。（如圖示）7. 及時(shí)清理廢液。（尤其過(guò)夜純化蛋白時(shí)，要檢查廢液是否裝滿）利用AKTA Prime Plus過(guò)分子篩1. 打開(kāi)AKTA將A泵用蒸餾水沖洗干凈插入到gel filtration buffer中，并在Template 中選擇 system wash,洗泵（大概五分鐘）。并用 gel filtration buffer 手動(dòng)或者程序設(shè)定清洗上樣環(huán)。2. sy

11、stem wash完畢后，先選擇 manual run，%B=0 pressure limitation= MPa，流速=2 ml/min（根據(jù)不同分子篩設(shè)定流速）。先將AKTA上 1號(hào)接線口濕接上部 分子篩，此時(shí)觀察柱子管道是否有氣泡，如果有氣泡那么應(yīng)該將1號(hào)接口線濕接到分子篩尾部接口，待分子篩頭部管道空氣排清后再正過(guò)來(lái)接柱子，最 后將柱子尾部接口接到探測(cè)器上。觀察電腦屏幕待UV線、電導(dǎo)線平齊時(shí)Endprogram。3. Super loop接上，6號(hào)出口線接super loop上面，下面出來(lái)接上 2號(hào)口。4. 設(shè)定程序（以30 ml樣品和320 ml分子篩為例）：流速：2 ml/min，限

12、壓：MPa，A 為 gel filtration buffer，全程 %B=00 ml： inject30 ml： load100 ml： load，set fraction size=8 ml/tube （此處的 break point 體積以各自的蛋白大小而定）400 ml： load，set fraction size=0End5. 蛋白純化結(jié)束后，要清洗 AKTA泵內(nèi)部溶液，方便下位同學(xué)使用，將 A泵用蒸餾水沖洗干凈插入到蒸餾水中，并在Template中選擇system wash,洗泵。6. 蛋白質(zhì)純化圖譜的保存與提取（1 ）保存：在電腦桌面打開(kāi) prime view evaluati

13、 on 軟件，打來(lái)文件夾，在里面按照時(shí)間順序找到你蛋白質(zhì)純化圖譜，然后點(diǎn)擊 file，選擇save as將你的圖保存在你的文件夾。（2）提?。狐c(diǎn)擊file,選擇export f curves 選擇 01: UV 和 06： Cone并在 Reduce number of samples中選 擇Reduce by 1。點(diǎn)擊保存，得到 excel表格，并用 Graphpad prism5做蛋白 純化圖譜。關(guān)鍵步驟：1. super loop上盡量不要有氣泡，如果有氣泡只能跟過(guò)鎳柱一樣快跑完時(shí)手動(dòng)調(diào)成load。所有參數(shù)在跑的過(guò)程中都可以改動(dòng)，因此雖然程序上接樣是從100ml-400 ml這么寬的范圍

14、進(jìn)行收集，但根據(jù)實(shí)際情況可以自己調(diào)。2. Super loop中的樣品如果只有30毫升，在設(shè)定程序時(shí)需要有所保留設(shè)定為 29毫升，以免分子篩里進(jìn)入氣泡。3. 在使用綠色上樣管時(shí)，請(qǐng)用注射器吸取少量gel filtration buffer，打入到綠色上樣管中（一是為了去除氣泡，而是為了去除管內(nèi)液體）。?維護(hù)注意事項(xiàng)（Maintenance ）1. 每天，除了連續(xù)使用外，當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成系統(tǒng)使用結(jié)束后，應(yīng)盡可能避免保存在裝載緩沖液狀態(tài)過(guò)夜。尤以高鹽濃度洗脫緩沖液為甚！假如，不能避免，則緊 記次日盡早用System Wash Method完成以蒸餾水將系統(tǒng)徹底清洗，才予以 保存或再更新使用其它緩沖液，再

15、次投入使用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。用蒸餾水將剩 下的緩沖液徹底沖洗出系統(tǒng)，這步驟至關(guān)重要。此舉不但可以避免緩沖液對(duì) 系統(tǒng)造成腐蝕機(jī)會(huì)，或因使用高鹽濃度緩沖液保存過(guò)久造成鹽結(jié)晶等的堵 塞，對(duì)系統(tǒng)構(gòu)成不必要的損害和損耗。2. （我們機(jī)器沒(méi)有pH探測(cè)器）任何時(shí)間當(dāng)不使用系統(tǒng)時(shí)，絕不要將pH電極留在流動(dòng)池里。請(qǐng)不應(yīng)將電極以水保存，否則這將使電極末端的玻璃膜，因長(zhǎng) 期保持于工作狀況下，會(huì)加速老化，甚或變干。電極可作以下處理：從流動(dòng) 池卸下pH電極。先以蒸餾水沖洗一遍，輕拭水份后，使其末端以其合適溶液泡浸保存。建議使用之保存溶液為：1摩爾KN03及pH值為4溶液（以1:1）的混合緩沖液。3. 若數(shù)天或更長(zhǎng)的時(shí)間不使

16、用系統(tǒng)，除用蒸餾水徹底清洗系統(tǒng)外。取下柱和pH電極（任選件）。通過(guò)細(xì)管道替換柱，并安裝虛擬pH電極（如果使用）。然后用20%乙醇再?zèng)_洗所有使用的管件通道和所有的流動(dòng)池一遍，然后并以 此將系統(tǒng)保存。（pH電極應(yīng)先行處理，參看上面2節(jié)的說(shuō)明）。UV流動(dòng)池也 可以如上所述地用蒸餾水沖洗然后用 20%乙醇通過(guò)流動(dòng)池。但如需要也可吹 乾存放，重新放置上紅的保護(hù)罩。在此并不建議使用壓縮空氣使之吹乾，因 為其內(nèi)可能含有油滴，造成污染。建議使用低壓高純氮?dú)饣驊喰詺怏w（如氬 氣等）。4. 每月定期保養(yǎng)處理，或當(dāng)發(fā)現(xiàn)假峰等問(wèn)題出現(xiàn)時(shí)，可拆下柱子，并用適宜的毛細(xì)管道替換其位置，將所有的緩沖液入口管件置于 1摩爾NaOH中，對(duì)所有 的入口管件通路運(yùn)行System Wash Method,以流速為每分鐘1毫升，將整個(gè) 系統(tǒng)充分沖洗若20分鐘。然后立即用蒸餾水，以通條件將整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行 System Wash Method加以沖洗20 分鐘。5. 當(dāng)裝配部分收集器出口管架時(shí)，應(yīng)根據(jù)收集管的長(zhǎng)度不同而使用不同的切換口。調(diào)整時(shí)可將出口管和管夾放在輸送臂上的長(zhǎng)度導(dǎo)向小孔上，將管夾底在 孔外臂上，將出口管輕推向下到達(dá)導(dǎo)向孔的底部，然后上緊管夾螺母。此可 確保出口管露出正確的長(zhǎng)度，以免造成跳管或收集體積錯(cuò)誤情況發(fā)生。6. 一定要保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔，當(dāng)使用儀器時(shí)