蝙蝠葛酚性堿對腦缺血大鼠細胞凋亡相關蛋白PKB表達的影響

1、蝙蝠葛酚性堿對腦缺血大鼠細胞凋亡相關蛋白PKB表達的影響 作者：杜永強， 白云， 趙大卓， 姜波， 蘇云明【摘要】 目的： 探討蝙蝠葛酚性堿（phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD）預處理對腦缺血后大腦皮質(zhì)細胞凋亡蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)表達的影響。方法： 采用線栓阻塞大腦中動脈方法制備大鼠腦缺血模型，并用受試藥物術前連續(xù)預處理模型大鼠7 d。采用免疫組織化學方法測定假手術組，模型組，PAMD高、中、低劑量組，尼莫地平、銀杏葉片預處理組大鼠缺血后24，48，72 h大腦皮質(zhì)中細胞凋亡相關蛋白PKB表達變化

2、。結(jié)果： 行大腦中動脈閉塞后大鼠大腦皮質(zhì)PKB均被誘導表達，PAMD預處理7 d后，缺血后各時間點大鼠大腦皮質(zhì)PKB表達明顯升高。結(jié)論： PAMD能明顯促進缺血腦損傷后抑制細胞凋亡相關蛋白PKB表達水平，從而在缺血性腦損傷中起到神經(jīng)保護作用。 【關鍵詞】 腦缺血； 蝙蝠葛酚性堿； 細胞凋亡； 蛋白激酶B Abstract Objective: Study and explore the express of gene and protein of protein kinase B(PKB) about cerebral ischemia effects of phenolic alkaloid

3、s from Menispermum dauricum（PAMD）on cerebral ischemia in rats. Methods： In order to observe the neuroprotective effect of PAMD on cerebral ischemia, the rats with incomplete cerebral ischemia were induced with fishing lines in the middle cerebral artery (MCA) and then were executed at 24, 48 and 72

4、h after cerebral ischemia. The effects of PAMD on protein expression of PKB was detected with immunohistochemical method. Results： The PKB was induced express after MCAO of cerebral cortex in rats. The express of PKB was increased sharply at each time after executed by PAMD for 7 days. Conclusion： P

5、AMD promoted the express of cell apoptosis protein PKB with cerebral ischemia injured and had protecting effect on cerebral ischemia.2 / 13 Key words cerebral ischemia；phenolic alkaloids from Menispermum dauricum；cell apoptosis；protein kinase B 腦血管病（CVD）是中老年人的常見病、多發(fā)病、疑難病，以其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率受到國內(nèi)外重視，成為中西

6、藥物治療研究的熱點領域。腦血管疾病中，缺血性腦血管?。↖CVD）占了大部分，嚴重危害著人類的健康。腦缺血后神經(jīng)元的死亡包括壞死和凋亡兩種方式，腦功能的損傷程度與缺血程度及時間呈正相關，嚴重缺血的中心區(qū)以壞死為主，周邊區(qū)(半暗帶)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death, DND)則以凋亡為主1。自1991年蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)被克隆以來，雖然PKB的研究工作己經(jīng)展開，但仍有許多問題尚未闡明。PKB在細胞生長、代謝、凋亡中扮演了很重要的角色2。PKB研究的另一個方向就是以它作為分子基礎，尋找治療糖尿病、惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的藥物3,4

7、。 蝙蝠葛酚性堿（phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD）是從中藥北豆根中提取的多種脂溶性生物堿的混合物，主要含有蝙蝠葛堿（dauricine，Dau）和蝙蝠葛蘇林堿（daurisoline，DS），其他成分含量甚微。近年來，對PAMD的藥理作用及其機制進行的大量研究，主要集中在對心血管系統(tǒng)的作用、對腦缺血及缺血再灌注損傷的保護作用、抗腫瘤等作用研究上。本研究建立大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型，通過觀察PAMD對細胞凋亡相關蛋白PKB表達的影響來闡明其對ICVD的預防作用，為臨床進一步闡明腦缺血損傷的機制和保護腦組織奠定基礎，同時

8、也為PAMD的新藥開發(fā)及臨床應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 藥品及主要試劑 PAMD由黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院王棟教授提供，用時先以1 mol/LHCl溶解后，再用1 mol/LNaOH調(diào)pH值至中性，加蒸餾水至所需濃度。尼莫地平片(西安博愛制藥有限公司，批號：國藥準字H61020545)；銀杏葉片(唐山榮大藥業(yè)有限公司，批號：國藥準字Z20027958)；12.5 /l肝素（上海生化）；水合氯醛（昆山）；低聚甲醛（天津）。 1.2 儀器設備 YT6生物組織攤烤片機（湖北）；生物組織包埋機（湖北孝感）；DGX9143B1電熱鼓風干燥箱（上海?，敚?；光學顯微鏡（Olympus

9、 Japan BH2）；Q500IW圖像分析儀（德國Leica）。 1.3 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠200只，體質(zhì)量（300±20），鼠齡45個月，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物許可證號：黑動字P00101006。 1.4 實驗方法 1.4.1 動物分組及給藥方法 將大鼠適應性喂養(yǎng)7 d, 隨機分成PAMD高、中、低劑量組，西藥陽性對照組，中藥陽性對照組，模型對照組及假手術組。PAMD高劑量組100 mg/kg、中劑量組50 mg/kg、低劑量組25 mg/kg，西藥陽性對照組給予尼莫地平21.6 mg/kg，中藥陽性對照組給予銀杏葉片135 mg/kg，模

10、型對照組及假手術組給予等容積生理鹽水，各組均灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，末次給藥后30 min制備MCAO模型。 1.4.2 MCAO模型制備 采用稍加改良的Longa方法5，將Wistar大鼠制備為MCAO模型。操作方法簡述如下：單紗尼龍線，直徑0.180.20 mm，長2.5 cm，在乙醇燈火焰旁，使其一頭端形成光滑圓球狀，經(jīng)紫外線照射消毒后備用。用10%水合氯醛350 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢固定于手術臺上，頸部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾。行頸部正中切口，逐層分離并顯露右側(cè)頸總動脈(CCA)，小心分離右側(cè)CCA，頸內(nèi)動脈(ICA)，頸外動脈(ECA)，避免刺激迷走神經(jīng)。

11、在CCA，ICA，ECA上各置一根30絲線。在距ICA、ECA分叉5 mm處結(jié)扎CCA，在ECA根部結(jié)扎ECA。提拉預置在ICA上的絲線，將ICA血流阻斷，在距ICA、ECA分叉5 mm的CCA上剪一“V”形切口。將尼龍線烤鈍的一端插入CCA上的小口，放松ICA上預置的絲線，將尼龍線經(jīng)CCA插入ICA內(nèi)，向前徐進1820 mm，稍遇阻力即停止徐進。將預置在ICA上的絲線扎緊，防止出血和栓子滑出?？p合皮膚，術畢。術中大鼠出現(xiàn)呼吸困難、出血過多者棄之。MCAO術后(大鼠意識恢復后30 min)對腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺陷進行評分，計分在13分以上者納入研究。 1.4.3 腦組織PKB蛋白含量測定 行為

12、學檢測完畢后，10水合氯醛麻醉（350 mg/kg），快速開胸顯露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室插管至升主動脈內(nèi)，于5 min內(nèi)快速灌注150 ml左右肝素化生理鹽水，隨后滴注含4%低聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液200 ml，緩慢灌注并固定。灌注完畢，從枕骨大孔剪開，完整取腦，在相同固定液中4固定不超過48 h。而后制作病理組織片；以PV6001二步法操作，終止反應后，蘇木精復染，清水沖洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片觀察。 1.4.4 圖像分析 陽性細胞數(shù)計數(shù)方法：400倍光鏡下在缺血梗死灶周邊區(qū)皮質(zhì)選擇5個不重疊的視場，計數(shù)陽性染色的細胞數(shù)，取其平均值。 1.4.5 統(tǒng)計

13、學分析 結(jié)果采用SPSS11.5 for Windows統(tǒng)計軟件分析處理，采用t檢驗。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。 2 結(jié) 果 PAMD對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)PKB蛋白表達的影響實驗結(jié)果見表1,圖1。表1 蝙蝠葛酚性堿對腦組織PKB蛋白含量的影響實驗觀察24，48及72h 3個時間點PAMD對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)PKB蛋白表達的影響，結(jié)果顯示在各時間點中，模型對照組與假手術組比較，PKB蛋白表達均有增加，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。同時PAMD高、中、低劑量組及尼莫地平對照組、銀杏葉片對照組分別與各時間點對應的模型對照組比較，PKB蛋白表達均有不同程度的

14、增加，其中術后24 h時間點PAMD中劑量組、西藥陽性對照組、中藥陽性對照組與模型對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；術后48 h及72 h時間點PAMD高、中劑量組及尼莫地平對照組、銀杏葉片對照組與模型對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。除假手術組外，各組隨時間變化PKB蛋白表達均有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 3 討 論 PKB又稱Akt6，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過PI3K激活。PI3K可使Akt的Ser473和Thr308位點磷酸化，激活后的Akt主要通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應，包括抗細胞凋亡、促細胞生存

15、功能。 目前研究表明，磷酸化后的Akt可通過作用于BAD，Caspase9，GSK3，CREB和Forkhead轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等底物或下游環(huán)節(jié)而促進細胞生存。研究發(fā)現(xiàn)，在短暫性全腦缺血早期階段，缺血損傷相對較輕的部位如大腦皮質(zhì)區(qū)磷酸化Akt表達增高。這種腦缺血早期Akt的激活是機體對腦缺血的一種保護性反應，與促進細胞存活有關。Yano等7在沙土鼠全腦缺血模型中，發(fā)現(xiàn)2 min腦缺血預處理能明顯增加磷酸化Akt的核表達，并且持續(xù)至腦缺血再灌注后7 d，提示Akt的磷酸化激活參與腦缺血耐受機制的形成。但到目前為止，尚沒有關于永久性大腦中動脈阻塞大鼠PKB蛋白表達的報道。

16、本實驗采用免疫組織化學法，觀察MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)PKB蛋白表達的動態(tài)變化，結(jié)果顯示，假手術組PKB蛋白表達較少而模型對照組PKB蛋白表達量增多，提示局灶性腦缺血可以誘導其表達。PAMD各治療組PKB蛋白表達較模型對照組又有不同程度的增加，提示PAMD對于大鼠局灶腦缺血損傷后PKB蛋白的表達有促進作用，可能是其抗神經(jīng)損傷的作用機制之一。PKB主要表達在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)，少量表達在胞核，在缺血側(cè)腦皮層、基底節(jié)、及腦缺血半暗帶區(qū)表達明顯增強，而對側(cè)腦半球也有大量表達。隨著缺血時間的延長，PKB蛋白陽性細胞有逐漸增多的趨勢，于72 h達到高峰。本研究顯示PAMD通過促進凋亡抑

17、制蛋白PKB的表達對腦缺血早期的損傷起到保護作用?！緟⒖嘉墨I】 1 Datta SR,Brunet A,Greenberg ME,et al.Cellular survival:a play in three AktsJ.Genes Dev,1999,13(22):2905-2927.2 周 穎，王 建，賀福初.蛋白激酶B(PKB/Akt)的結(jié)構(gòu)、調(diào)控與功能J.生命的化學，2006，26（3）：226-228.3 Hill MM,Hemmings BA.Inhibition of protein kinase B/Akt implications for cancer therapyJ.Pha

18、rmacol Ther,2002,93(2):243-251.4 Li Q,Zhu GD,Targeting serine/threonine protein kinase B/Akt and cellcycle check point kinases for treating cancerJ.Curr Top Med Chem,2002,2(9):939-971.5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S,et a1.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in ratsJ.Stroke,1989.20(1):84-91.6 Gao F,Gao E,Yue TL.Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemiareperfusion: the roles of PI3kinase,Akt and e