用改良消減法克隆類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞中的高表達基因

1、用改良消減法克隆類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞中的高表達基因作者：王吉村藥立波呂厚山劉新平鄧艷春趙忠良聶曉燕孫鐵錚燕太強 【關鍵詞】改良消減雜交法 關鍵詞:改良消減雜交法;滑膜細胞;類風濕性關節(jié)炎 0引言 在類風濕性關節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）中，關節(jié)內滑膜細胞（fibroblast-likesynovialcells，F(xiàn)LS）的過度增生是造成關節(jié)軟骨破壞和關節(jié)畸形的關鍵環(huán)節(jié)，為了研究滑膜細胞發(fā)生增殖的機制，我們采用趙忠良等人設計的改良消減雜交法1，并以骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）滑膜細胞為對照篩選RA滑膜細胞中的高表達基因. 1方法 將RA滑膜細胞和OA

2、滑膜細胞分別設定為實驗組和扣除組，用扣除組的cDNAs雜交扣除掉實驗組中與前者相同的cDNAs，得到的就是目的產物:實驗組中高拷貝數(shù)的或獨有的cDNAs，也就是RA滑膜細胞中高表達的cDNAs.具體步驟為:分別提取RA和OAFLS的mRNAs，對于實驗組RAmRNAs，反轉錄時采用帶錨定序列的反轉錄引物，引物序列為5-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT（30）N-1N-3，同時在反應體系中加入根據(jù)mRNA52 / 9GGG帽結構設計的5錨定引物，序列為5-AAGCAGTGGTAA-CAACGCAGAGTACGCGGG-3，使其在反轉錄時在cDNA5末端引入與3端相同的錨定序列

3、.對于扣除組OAmR-NAs，采用普通的反轉錄方法;將扣除組OAcDNAs通過隨機引物PCR擴增，摻入Biotin-dUTP，制成扣除探針;將實驗組RAcDNAs與過量OA扣除探針進行液相雜交，然后用連有鏈親和素的磁珠分離雜交產物，去除雜交體和未雜交上的扣除探針;以未雜交上的RAFLScDNA為模板進行長距離PCR擴增，兩側引物序列均為5-AAGCAGTG-GTAACAACGCAGAGT-3，將擴增產物回收并克隆入質粒載體;酶切質粒，將回收的酶切片段點于硝酸纖維素膜上，與扣除組cDNAs進行反向點雜交，排除假陽性克隆后，將陽性克隆測序. 2結果 酶切顯示，在已鑒定的150個白色克隆中，55個（

4、占36.7%）克隆的插段長度大于400bp.12個（占8%）克隆的插段長度大于1000bp.反向點雜交結果表明，55個克隆中，假陽性克隆為13個，占23.7%.對42個陽性克隆中的18個進行序列分析顯示，其中12個為已知基因，占66.7%;分別為核糖體蛋白S4，S23，S25基因、干擾素誘導基因、鐵蛋白輕鏈基因、層粘連蛋白受體基因、轉化生長因子基因、tubu-lin-polypeptide基因、組織蛋白酶B基因、前I型膠原基因、A-raf原癌基因和IGF-1結合蛋白特異性絲氨酸蛋白酶基因，這些序列大多為已知基因的3部分.另外，還有6個克隆為新序列，占33.3%.序列分析表明，這六個新序列均有編

5、碼區(qū)，其中4個序列各有一完整讀框，分別編碼85個氨基酸（aminoacids，aa），45aa，139aa和45aa，另外兩個序列分別為各自讀框的5部分（135aa）和3（75aa）部分. 3討論 3.1關于改良消減雜交法這種方法是本室趙忠良博士等首先建立的，此方法較代表性差異分析技術和抑制消減雜交法等兩種消減雜交技術有兩點改進之處:一是在反轉錄時將實驗組cDNAs的兩端分別引入錨定序列，這不僅有利于雜交后差異基因的擴增和克隆，而且有利于獲得全長cDNA或較長cDNA片段;二是扣除探針中摻入生物素，這樣利用生物素與鏈親和素結合的特性，就可以將雜交混合物中的雜交體和未雜交上的扣除組成分去掉. 本

6、研究發(fā)現(xiàn)，在所得到的基因片段中，8%長于1000bp，36.7%長于400bp，而且6個新序列都有編碼區(qū)，反向點雜交顯示，假陽性率為23.6%.所以無論從獲得片段的長度上還是特異性上都明顯優(yōu)于差示PCR方法.另外，在測序克隆中，33.3%為新序列，在已知基因中，轉化生長因子基因和A-raf原癌基因等都是表達豐度較低的基因，提示這種方法可以克隆到低豐度的差異表達基因，在這一點上，它要優(yōu)于代表性差異分析技術和抑制消減雜交法.還有，此方法的簡便快捷也是顯而易見的. 但實驗中也發(fā)現(xiàn)了兩個問題，一是擴增產物不易被克隆，大片段尤其如此;二是很多片段還不完整，為已知基因3部分.分析原因，可能是由于PCR過程

7、中循環(huán)數(shù)太多，導致因引物的不足使PCR產物中單鏈cDNAs太多所造成. 3.2一些高表達的已知基因與滑膜細胞病變的關系 3.2.1絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一類細胞分泌的具有底物相對特異性的蛋白酶.RA滑膜細胞高表達的這種蛋白酶是IGF-1結合蛋白（IGF-1bindingprotein，IGFBP）特異性的絲氨酸蛋白酶，它可分解IGFBP，而IGF-1結合蛋白的減少有利于IGF-1游離而發(fā)揮生物學活性3.所以RA滑膜細胞可能通過以下途徑:“分泌絲氨酸蛋白酶-分解IGFBP-提高游離IGF-1水平”來促進滑膜細胞的增殖，若這條途徑存在，則絲氨酸蛋白酶就可成為抑制滑膜細胞增殖的一個新靶點.所以有

8、必要進一步研究絲氨酸蛋白酶在RA滑膜細胞中的作用. 3.2.2A-rafA-raf是一類原癌基因，它所編碼的蛋白A-Raf是一種重要的細胞內信號轉導分子，并在介導細胞增殖、分化和凋亡中具有重要意義.A-raf基因的表達水平增高和活化可能是RA滑膜細胞過度增殖的細胞內機制，同時也提示，Ras-Raf-MAPK信號轉導途徑可能是介導滑膜細胞增殖的一個主要途徑. 3.2.3組織蛋白酶B有研究表明，組織蛋白酶B參與RA關節(jié)破壞.Lemaire等4研究也發(fā)現(xiàn)，在一些細胞因子刺激下，滑膜細胞選擇性分泌組織蛋白酶B和L，所以RA患者滑膜細胞高表達組織蛋白酶B可能是受炎癥因子刺激所至.高表達組織蛋白酶B可能是

9、RA滑膜細胞表現(xiàn)有軟骨侵蝕性的一個重要原因. 參考文獻: 1ZhaoZ，HuangX，LiNetal.Directcloningofcelldifferentialexpressiongeneswithfull-lengthbyanewstrategybasedonthemultipleroundsoflongdistancepolymerasechainreactionandmagneticbeadsmediatedsubtractionJ.JBiotechnol，1999;73（1）:35-41. 2KumonY，SuehiroT，HashimotoKetal.Localexpressionofa-cutephaseserumamyloidAmRNAinrheumatoidarthritissyn-ovialtissueandcellsJ.JRheumatol，1999;26（4）:785-790. 3LowmanHB，ChenYM，SkeltonNJetal.Molecularmimicsofinsulin-likegrowthfactor1（IGF-1）forinhibitingIGF-1:IGF-bindingproteininteractionsJ.Biochemistry，1998;37（25）:8870-8878.