四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官AngⅡ和CGRP表達(dá)的影響

1、四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官Ang 和CGRP表達(dá)的影響【摘要】 目的 探討四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官血管緊張素（Ang）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）表達(dá)的影響。方法 選擇健康雌性Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為正常對照組、腎性高血壓組和四逆湯治療組，每組8只。雙腎動(dòng)脈夾閉法建立腎性高血壓動(dòng)物模型，免疫組化法測定心、腦、腎組織中Ang和CGRP的表達(dá)。結(jié)果 腎性高血壓組大鼠各器官CGRP和Ang表達(dá)水平較正常對照組均顯著升高。四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達(dá)水平較腎性高血壓組均明顯降低；四逆湯治療組大鼠Ang在腎臟和心臟的表達(dá)水平較腎性高血壓組均明顯降低，但在腦組織中的表達(dá)差異無

2、顯著性。結(jié)論 四逆湯可能通過調(diào)節(jié)腎性高血壓大鼠腎、心、腦組織中血管活性物質(zhì)Ang和CGRP的表達(dá)水平，發(fā)揮其血壓調(diào)節(jié)作用。 【關(guān)鍵詞】 四逆湯 高血壓 腎性 心臟 腎 腦 血管緊張素 降鈣素基因相關(guān)肽 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo investigate the effects of Sinitang on the expressions of angiotensin(Ang) and calcium gene related peptide (CGRP) in the main target organs of renal hypertension rats.MethodsT

3、wentyfour healthy female Wistar rats were evenly divided into normal control (NC) group, renal hypertension (RH) group and Sinitang treatment (ST) group. The renal hypertension models were established by clipping both renal arteries. The expressions of Ang2 / 13 and CGRP in tissues of heart, brain a

4、nd kidney were determined immunohistochemically.ResultsThe expressions of CGRP and Ang in tissues of kidney, heart and brain in RH group were higher than those of NC group. The expressions of CGRP in kidney, heart and brain and those Ang in kidney and heart in ST group were lower than those of RH gr

5、oup, no significant difference was found in the expression of Ang in brain tissue compared between RH and ST groups.ConclusionThe bloodpressureregulating action of Sinitang is probably through adjusting the expression levels of CGRP and Ang in renal, heart and brain tissues of the experimental rats.

6、 KEY WORDSSinitang; hypertension, renal; heart; kidney; brain; angiotensin ; calcitonin generelated peptide; rats 高血壓按病因可分為自發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中自發(fā)性高血壓最多見，占高血壓病人的95%以上，少數(shù)病人繼發(fā)于腎臟疾病、嗜鉻細(xì)胞瘤等。但無論何種病因，高血壓發(fā)生發(fā)展的病理生理過程是相似的，都是由縮血管活性物質(zhì)和舒血管活性物質(zhì)分泌失衡引起阻力血管的收縮、痙攣直至發(fā)生血管結(jié)構(gòu)的改變。全身血管結(jié)構(gòu)和功能的改變導(dǎo)致機(jī)體重要器官心、腦、腎的損害，如心肌缺血或心臟衰竭、腦梗死或出血

7、、腎衰竭。高血壓目前是全球高發(fā)病，我國人群患病率高達(dá)11.26%1，然而目前對于高血壓仍缺乏行之有效的預(yù)防和治療手段。本實(shí)驗(yàn)在成功制作雙腎雙夾型腎性高血壓大鼠模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用中藥方劑四逆湯治療，測定參與高血壓發(fā)生發(fā)展的血管緊張素（Ang）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等活性物質(zhì)在局部組織的表達(dá)水平，以探討四逆湯對高血壓的治療作用和機(jī)制。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 成年健康雌性Wistar大鼠24只，3月齡，體質(zhì)量180200 g，SPF級，由青島市藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（魯）20030010，22 室溫下常規(guī)喂養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對照組、腎性高血壓組和四逆

8、湯治療組，每組8只。 1.2 動(dòng)物模型制備 根據(jù)雙腎動(dòng)脈夾閉法建立腎動(dòng)脈狹窄性高血壓動(dòng)物模型2，應(yīng)用RBF2型大鼠尾動(dòng)脈血壓計(jì)（北京中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所）反復(fù)測量3次，取均值，以血壓大于17.29 kPa為造模成功的標(biāo)志，不成功的動(dòng)物及術(shù)中出血過多、手術(shù)操作時(shí)間超過30 min、術(shù)后2 h仍不蘇醒以及狀態(tài)不好的動(dòng)物，予以剔除，另選動(dòng)物補(bǔ)齊。正常對照組不做任何處理。 1.3 治療方案 四逆湯提取物由北京大學(xué)天然藥物與仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全方給藥（附子5 g，干姜4.5 g，甘草6.0 g，合計(jì)15.5 g），每千克體質(zhì)量0.04副，合提取物155 mg/kg。用蒸餾水將提取

9、物配制成20 g/L水溶液。動(dòng)物造模成功后，四逆湯治療組動(dòng)物按7.75 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)應(yīng)用14 d，腎性高血壓組動(dòng)物同步給予等量的生理鹽水，正常對照組不做處理。 1.4 標(biāo)本采集和處理 治療結(jié)束后，麻醉動(dòng)物，仰臥固定，打開腹腔，依次經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水200 mL和40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL固定，迅速取心、腎、腦、動(dòng)脈，置于40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL中后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，置體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇中保存?zhèn)溆?。常?guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。腎臟沿長軸縱向切片，心臟垂直于長軸沿橫切面切片，腦自視交叉后方連續(xù)

10、冠狀切片，厚度7 m，每隔10張抽取一張，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的切片上，室溫保存?zhèn)溆谩?1.5 免疫組化檢測 兔抗大鼠Ang和CGRP單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接法（SP）免疫組化試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。切片常規(guī)脫蠟、水化，按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，光鏡下觀察，胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽性著色。部分切片不加一抗，以0.1 mol/L PBS代替，不出現(xiàn)陽性著色。高倍鏡下（100倍）隨機(jī)各取4個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞（心臟取心肌細(xì)胞的橫截面），以±s表示。 2 結(jié) 果 2.1 Ang表達(dá) 心臟內(nèi)Ang陽性表達(dá)見于心肌細(xì)

11、胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞；腦內(nèi)陽性細(xì)胞見于皮質(zhì)、腦室脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞；腎臟內(nèi)Ang陽性表達(dá)見于腎小球血管內(nèi)皮、血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔側(cè)，少量分布于近曲小管上皮細(xì)胞。 腎性高血壓組心、腎Ang表達(dá)水平均顯著高于正常對照組，四逆湯治療組心、腎Ang表達(dá)水平均顯著低于腎性高血壓組（F=14.5617.28，q=4.126.07，P<0.01）。3組腦內(nèi)Ang表達(dá)水平比較差異無顯著性。見表1。表1 各組靶器官Ang表達(dá)水平的比較 2.2 CGRP表達(dá) 在心肌細(xì)胞橫切面上，CGRP陽性顆粒主要位于心肌細(xì)胞膜周邊，呈現(xiàn)為細(xì)密的顆粒；在心肌細(xì)胞縱切面上，CGRP陽性顆粒呈線形與心肌纖維走行一致。腦

12、內(nèi)CGRP陽性細(xì)胞分布于皮質(zhì)、海馬神經(jīng)細(xì)胞。腎臟CGRP陽性顆粒，主要分布于腎小管上皮細(xì)胞表面和血管平滑肌細(xì)胞。 腎性高血壓組大鼠各器官CGRP表達(dá)水平較正常對照組均顯著升高（F=4.127.33,q=3.415.74，P<0.05)；四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達(dá)水平較腎性高血壓組均明顯降低（q=4.366.87，P<0.01）。見表2。表2 各組靶器官CGRP水平的比較 3 討 論 Ang是腎素血管緊張素醛固酮（RAS）系統(tǒng)中發(fā)揮主要功能的活性物質(zhì)。RAS系統(tǒng)既是循環(huán)內(nèi)分泌系統(tǒng)，也是全身分布的局部內(nèi)分泌系統(tǒng)3。腎性高血壓模型大鼠腎動(dòng)脈血流減少，腎臟致密斑釋放

13、腎素增加，將血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素，后者在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的作用下轉(zhuǎn)變成Ang，從而激活循環(huán)中的RAS系統(tǒng)4。Ang不僅通過促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌醛固酮增加，造成體內(nèi)水鈉潴留，而且是強(qiáng)有力的血管收縮劑，能夠使全身阻力血管收縮。持續(xù)高水平的Ang導(dǎo)致全身小動(dòng)脈的持續(xù)痙攣，痙攣引起的血管組織缺血進(jìn)一步造成內(nèi)皮功能的損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮分泌的血管收縮因子和血管舒張因子分泌失衡。同時(shí)，Ang還能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的增生5。有研究指出，參與血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞增殖的主要是局部的RAS系統(tǒng)6，牽拉可以促進(jìn)心肌細(xì)胞Ang的自分泌增加，高血壓心肌肥厚程度與心肌內(nèi)Ang水平呈顯著正相

14、關(guān)。另外，腎臟局部的Ang通過調(diào)節(jié)腎血流量和腎小球?yàn)V過率，以及通過促進(jìn)腎小管對鈉離子的重吸收等作用促進(jìn)高血壓的發(fā)生發(fā)展7。 CGRP是由分布于全身血管組織的感覺神經(jīng)釋放的血管活性神經(jīng)肽，是體內(nèi)最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)8。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮素（ET）和CGRP的相對平衡維持著血管壁的張力，CGRP持續(xù)分泌維持血管的穩(wěn)定舒張，除此之外，腎臟內(nèi)的CGRP還具有直接的利鈉利尿的作用9，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中CGRP在腎臟的分布顯示，CGRP的這種效應(yīng)可能是通過直接作用于腎小管，調(diào)節(jié)其功能狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的。研究表明，Ang能夠抑制CGRP的釋放，ET、低氧則可促進(jìn)CGRP的釋放，腎性高血壓大鼠CGRP水平升高，推測其為代償

15、性升高，CGRP能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，并抑制醛固酮的分泌10，對抗Ang和ET的效應(yīng)。 本研究顯示，腎性高血壓組大鼠各器官CGRP和心、腎Ang表達(dá)水平較正常對照組均顯著升高，說明高血壓動(dòng)物CGRP和Ang合成增多；四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達(dá)水平較腎性高血壓組均明顯降低。總體分析，四逆湯可能通過調(diào)節(jié)高血壓大鼠體內(nèi)舒縮血管活性物質(zhì)的平衡，從而抑制高血壓的發(fā)生和發(fā)展，而且其降壓作用可能主要是從心血管系統(tǒng)和靶器官兩方面實(shí)現(xiàn)的。 【參考文獻(xiàn)】 1全國血壓抽樣調(diào)查協(xié)作組. 中國人群高血壓患病率及其變化趨勢J. 中國高血壓雜志, 1995,3(1):713. 2郭云良,姚維成,高煥民,等.

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