四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官AngⅡ和CGRP表達的影響

1、四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官Ang 和CGRP表達的影響【摘要】 目的 探討四逆湯對腎性高血壓大鼠主要靶器官血管緊張素（Ang）和降鈣素基因相關肽（CGRP）表達的影響。方法 選擇健康雌性Wistar大鼠24只，隨機分為正常對照組、腎性高血壓組和四逆湯治療組，每組8只。雙腎動脈夾閉法建立腎性高血壓動物模型，免疫組化法測定心、腦、腎組織中Ang和CGRP的表達。結果 腎性高血壓組大鼠各器官CGRP和Ang表達水平較正常對照組均顯著升高。四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達水平較腎性高血壓組均明顯降低；四逆湯治療組大鼠Ang在腎臟和心臟的表達水平較腎性高血壓組均明顯降低，但在腦組織中的表達差異無

2、顯著性。結論 四逆湯可能通過調節(jié)腎性高血壓大鼠腎、心、腦組織中血管活性物質Ang和CGRP的表達水平，發(fā)揮其血壓調節(jié)作用。 【關鍵詞】 四逆湯 高血壓 腎性 心臟 腎 腦 血管緊張素 降鈣素基因相關肽 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo investigate the effects of Sinitang on the expressions of angiotensin(Ang) and calcium gene related peptide (CGRP) in the main target organs of renal hypertension rats.MethodsT

3、wentyfour healthy female Wistar rats were evenly divided into normal control (NC) group, renal hypertension (RH) group and Sinitang treatment (ST) group. The renal hypertension models were established by clipping both renal arteries. The expressions of Ang2 / 13 and CGRP in tissues of heart, brain a

4、nd kidney were determined immunohistochemically.ResultsThe expressions of CGRP and Ang in tissues of kidney, heart and brain in RH group were higher than those of NC group. The expressions of CGRP in kidney, heart and brain and those Ang in kidney and heart in ST group were lower than those of RH gr

5、oup, no significant difference was found in the expression of Ang in brain tissue compared between RH and ST groups.ConclusionThe bloodpressureregulating action of Sinitang is probably through adjusting the expression levels of CGRP and Ang in renal, heart and brain tissues of the experimental rats.

6、 KEY WORDSSinitang; hypertension, renal; heart; kidney; brain; angiotensin ; calcitonin generelated peptide; rats 高血壓按病因可分為自發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中自發(fā)性高血壓最多見，占高血壓病人的95%以上，少數病人繼發(fā)于腎臟疾病、嗜鉻細胞瘤等。但無論何種病因，高血壓發(fā)生發(fā)展的病理生理過程是相似的，都是由縮血管活性物質和舒血管活性物質分泌失衡引起阻力血管的收縮、痙攣直至發(fā)生血管結構的改變。全身血管結構和功能的改變導致機體重要器官心、腦、腎的損害，如心肌缺血或心臟衰竭、腦梗死或出血

7、、腎衰竭。高血壓目前是全球高發(fā)病，我國人群患病率高達11.26%1，然而目前對于高血壓仍缺乏行之有效的預防和治療手段。本實驗在成功制作雙腎雙夾型腎性高血壓大鼠模型的基礎上，應用中藥方劑四逆湯治療，測定參與高血壓發(fā)生發(fā)展的血管緊張素（Ang）和降鈣素基因相關肽（CGRP）等活性物質在局部組織的表達水平，以探討四逆湯對高血壓的治療作用和機制。 1 材料和方法 1.1 實驗動物分組 成年健康雌性Wistar大鼠24只，3月齡，體質量180200 g，SPF級，由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）20030010，22 室溫下常規(guī)喂養(yǎng)。隨機分為正常對照組、腎性高血壓組和四逆

8、湯治療組，每組8只。 1.2 動物模型制備 根據雙腎動脈夾閉法建立腎動脈狹窄性高血壓動物模型2，應用RBF2型大鼠尾動脈血壓計（北京中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所）反復測量3次，取均值，以血壓大于17.29 kPa為造模成功的標志，不成功的動物及術中出血過多、手術操作時間超過30 min、術后2 h仍不蘇醒以及狀態(tài)不好的動物，予以剔除，另選動物補齊。正常對照組不做任何處理。 1.3 治療方案 四逆湯提取物由北京大學天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室提供，實驗動物全方給藥（附子5 g，干姜4.5 g，甘草6.0 g，合計15.5 g），每千克體質量0.04副，合提取物155 mg/kg。用蒸餾水將提取

9、物配制成20 g/L水溶液。動物造模成功后，四逆湯治療組動物按7.75 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)應用14 d，腎性高血壓組動物同步給予等量的生理鹽水，正常對照組不做處理。 1.4 標本采集和處理 治療結束后，麻醉動物，仰臥固定，打開腹腔，依次經腹主動脈灌注生理鹽水200 mL和40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL固定，迅速取心、腎、腦、動脈，置于40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL中后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，置體積分數0.70乙醇中保存?zhèn)溆谩３Ｒ?guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。腎臟沿長軸縱向切片，心臟垂直于長軸沿橫切面切片，腦自視交叉后方連續(xù)

10、冠狀切片，厚度7 m，每隔10張抽取一張，貼于經多聚賴氨酸處理的切片上，室溫保存?zhèn)溆谩?1.5 免疫組化檢測 兔抗大鼠Ang和CGRP單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接法（SP）免疫組化試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。切片常規(guī)脫蠟、水化，按試劑盒提供的實驗步驟進行操作，DAB顯色，光鏡下觀察，胞漿出現棕色顆粒為陽性著色。部分切片不加一抗，以0.1 mol/L PBS代替，不出現陽性著色。高倍鏡下（100倍）隨機各取4個視野計數陽性細胞（心臟取心肌細胞的橫截面），以±s表示。 2 結 果 2.1 Ang表達 心臟內Ang陽性表達見于心肌細

11、胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞；腦內陽性細胞見于皮質、腦室脈絡膜內皮細胞；腎臟內Ang陽性表達見于腎小球血管內皮、血管內皮細胞管腔側，少量分布于近曲小管上皮細胞。 腎性高血壓組心、腎Ang表達水平均顯著高于正常對照組，四逆湯治療組心、腎Ang表達水平均顯著低于腎性高血壓組（F=14.5617.28，q=4.126.07，P<0.01）。3組腦內Ang表達水平比較差異無顯著性。見表1。表1 各組靶器官Ang表達水平的比較 2.2 CGRP表達 在心肌細胞橫切面上，CGRP陽性顆粒主要位于心肌細胞膜周邊，呈現為細密的顆粒；在心肌細胞縱切面上，CGRP陽性顆粒呈線形與心肌纖維走行一致。腦

12、內CGRP陽性細胞分布于皮質、海馬神經細胞。腎臟CGRP陽性顆粒，主要分布于腎小管上皮細胞表面和血管平滑肌細胞。 腎性高血壓組大鼠各器官CGRP表達水平較正常對照組均顯著升高（F=4.127.33,q=3.415.74，P<0.05)；四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達水平較腎性高血壓組均明顯降低（q=4.366.87，P<0.01）。見表2。表2 各組靶器官CGRP水平的比較 3 討 論 Ang是腎素血管緊張素醛固酮（RAS）系統(tǒng)中發(fā)揮主要功能的活性物質。RAS系統(tǒng)既是循環(huán)內分泌系統(tǒng)，也是全身分布的局部內分泌系統(tǒng)3。腎性高血壓模型大鼠腎動脈血流減少，腎臟致密斑釋放

13、腎素增加，將血管緊張素原轉化為血管緊張素，后者在血管緊張素轉換酶（ACE）的作用下轉變成Ang，從而激活循環(huán)中的RAS系統(tǒng)4。Ang不僅通過促進腎上腺皮質球狀帶分泌醛固酮增加，造成體內水鈉潴留，而且是強有力的血管收縮劑，能夠使全身阻力血管收縮。持續(xù)高水平的Ang導致全身小動脈的持續(xù)痙攣，痙攣引起的血管組織缺血進一步造成內皮功能的損傷，導致內皮分泌的血管收縮因子和血管舒張因子分泌失衡。同時，Ang還能夠誘導血管平滑肌細胞和心肌細胞的增生5。有研究指出，參與血管平滑肌細胞和心肌細胞增殖的主要是局部的RAS系統(tǒng)6，牽拉可以促進心肌細胞Ang的自分泌增加，高血壓心肌肥厚程度與心肌內Ang水平呈顯著正相

14、關。另外，腎臟局部的Ang通過調節(jié)腎血流量和腎小球濾過率，以及通過促進腎小管對鈉離子的重吸收等作用促進高血壓的發(fā)生發(fā)展7。 CGRP是由分布于全身血管組織的感覺神經釋放的血管活性神經肽，是體內最強的舒血管物質8。在正常生理狀態(tài)下，內皮素（ET）和CGRP的相對平衡維持著血管壁的張力，CGRP持續(xù)分泌維持血管的穩(wěn)定舒張，除此之外，腎臟內的CGRP還具有直接的利鈉利尿的作用9，根據本實驗中CGRP在腎臟的分布顯示，CGRP的這種效應可能是通過直接作用于腎小管，調節(jié)其功能狀態(tài)實現的。研究表明，Ang能夠抑制CGRP的釋放，ET、低氧則可促進CGRP的釋放，腎性高血壓大鼠CGRP水平升高，推測其為代償

15、性升高，CGRP能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖，并抑制醛固酮的分泌10，對抗Ang和ET的效應。 本研究顯示，腎性高血壓組大鼠各器官CGRP和心、腎Ang表達水平較正常對照組均顯著升高，說明高血壓動物CGRP和Ang合成增多；四逆湯治療組大鼠各器官CGRP表達水平較腎性高血壓組均明顯降低?？傮w分析，四逆湯可能通過調節(jié)高血壓大鼠體內舒縮血管活性物質的平衡，從而抑制高血壓的發(fā)生和發(fā)展，而且其降壓作用可能主要是從心血管系統(tǒng)和靶器官兩方面實現的。 【參考文獻】 1全國血壓抽樣調查協(xié)作組. 中國人群高血壓患病率及其變化趨勢J. 中國高血壓雜志, 1995,3(1):713. 2郭云良,姚維成,高煥民,等.

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