結(jié)核分枝桿菌furA基因片段的克隆、表達(dá)和分離純化

1、結(jié)核分枝桿菌furA基因片段的克隆、表達(dá)和分離純化 作者：高雪，薛瑩，姜泓，柏銀蘭，師長(zhǎng)宏，張海，李元，徐志凱 【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌 【Abstract】 AIM: To obtain furA (ferric uptake regulator A) gene segments of Mycobacteria tuberculosis (MTB), express efficiently in E.coli and purify the target proteins. METHODS: furA gene segments were amplified by PCR with specifi

2、c primers from genome of MTB H37Rv strain. After sequenced, furA gene segments were inserted into pRSETA and expressed in E.coli BL21. The recombinant (His)6 fused proteins were purified by NiNTA purification system. RESULTS: The length of PCR product was 453 bp, identical with that reported by Genb

3、ank. The proteins were expressed in E.coli BL21 as soluble proteins, accounting for 10 of the total bacterial proteins. SDSPAGE and Western blot showed that the Mr of this gene product was 23.0×103. The (His)6 fused proteins were purified by affinity chromatography. CONCLUSION: furA of MTB was

4、successfully cloned and expressed in E.coli BL21. The purified proteins are obtained by NiNTA purification system. This work lays the foundation for further study on the ferric uptake of Fe2+ in MTB. 2 / 14【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; FurA; cloning; expression; purification 【摘要】 目的： 獲得結(jié)核分枝

5、桿菌furA基因片段并高效表達(dá)、純化. 方法： 用PCR技術(shù)從MTB毒株H37RvDNA中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的DNA片段，將片段與pGEMTeasy 載體連接后測(cè)序. 將測(cè)序正確的furA按照BamH和Hind酶切位點(diǎn)克隆入原核表達(dá)載體pRSETA，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，挑出陽(yáng)性克隆，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組的(His)6融合蛋白. 對(duì)重組融合蛋白通過(guò)鎳柱進(jìn)行純化. 結(jié)果： PCR獲得的furA序列與Genbank報(bào)道的一致(為453 bp). 重組載體在E.coli BL21中以可溶形式高效表達(dá)，融合蛋白經(jīng)SDSPAGE和Western blot分析，在Mr為23.0×1

6、03處有特異的蛋白條帶，目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白量的10%，重組蛋白經(jīng)鎳柱進(jìn)行純化后，得到了高純度的FurA融合蛋白. 結(jié)論： 成功克隆結(jié)核分枝桿菌furA基因片段，并在E.coli BL21中高效表達(dá)，親和層析純化后獲得高純度FurA融合蛋白. 【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌，結(jié)核；FurA；克?。槐磉_(dá)；純化 0引言 鐵是維持結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)新陳代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，研究認(rèn)為通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑來(lái)調(diào)控基因表達(dá)從而抑制MTB生長(zhǎng)可以達(dá)到治療結(jié)核病的目的1. 研究鐵相關(guān)基因在MTB代謝過(guò)程中的作用，有助于我們深入了解MTB的致病機(jī)制，從而有效

7、地控制結(jié)核病的流行. MTB中包括四種鐵依賴的調(diào)節(jié)基因，它們編碼的蛋白分屬兩個(gè)家族，分別為Fur和DtxR. 其中Fur家族又包括FurA和FurB2,3. 目前對(duì)于DtxR家族蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究得比較清楚，而對(duì)Fur蛋白的研究比較少. 我們從MTB中克隆furA基因片段，并在原核細(xì)胞中表達(dá)并純化，為進(jìn)一步探索其在MTB中的作用奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 E.coli BL21, E.coli DH5, MTB H37Rv菌株表達(dá)載體及pRSETA由本室保存.寡聚核苷酸引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成；克隆質(zhì)粒pGEMTeasy載體、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、各種限制性

8、內(nèi)切酶、連接酶及Taq DNA聚合酶均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；IPTG為Sigma公司的產(chǎn)品；(His)6 mAb購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，HRP山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自華美生物公司；Ni2+NTA純化試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；其余一般化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法 1.2.1furA片段的擴(kuò)增參考文獻(xiàn)4方法獲得MTB H37Rv的DNA，以此為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1: 5GGATCCTCTAGTGTGTGTCCTCTATACCG3,含BamH酶切位點(diǎn)；P2: 5AAGCTTGTAATGGGTGGGTGTTGC3,含Hind酶切位點(diǎn). PCR反應(yīng)條件： 94 40 s,

9、 56 30 s, 72 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72延伸10 min. 1.2.2目的基因的測(cè)序與克隆回收PCR產(chǎn)物，用T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pGEMTeasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆，將提取的質(zhì)粒用BamH和Hind雙酶切，行瓊脂糖凝膠電泳，有目的片段的則為陽(yáng)性克隆，將篩選的陽(yáng)性克隆由上海博亞公司完成測(cè)序，命名為pGEMfurA. 1.2.3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將pGEMfurA被BamH和Hind雙酶切的片段與原核表達(dá)載體pRSETA連接，命名為pRSETAfurA. 將pRSETAfurA轉(zhuǎn)化入E.coli BL21中. 轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含

10、氨芐青霉素（50 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，按150的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37搖菌3 h至A=1，加入異丙基D 硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1.2 mmol/L, 37繼續(xù)通氣培養(yǎng)45 h.取5 mL菌液，收集菌體，菌體加入H2O 80 L，劇烈振蕩混勻，再加入2×樣品緩沖液80 L, 100水浴5 min，離心10 min；125 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)計(jì)Mr為23.0×103處有明顯表達(dá)條帶. 大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集菌體，超聲裂菌，離心后將上清和沉淀分別制樣，進(jìn)行可溶性分析. 如果目的蛋白為可溶性的直接用鎳離

11、子柱進(jìn)行親和層析純化. 1.2.4親和色譜法純化目的蛋白采用Invitrogen的Ni2+NTA純化試劑盒純化目的蛋白. 將50 mL的誘導(dǎo)菌液離心，制備上柱樣品，按照可溶性條件(native condition)進(jìn)行親和色譜純化，收集洗脫液，4保存. 1.2.5純化蛋白的Westernblot鑒定將上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行125 g/L SDSPAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶在37封閉1 h，加入15000稀釋的(His)6 mAb，37搖床孵育1 h，PBS洗滌3遍后，加入HRP山羊抗小鼠IgG抗體，37搖床孵育1 h，PBS洗滌3遍，加入底物液DAB顯色4. 2結(jié)果 2.1fu

12、rA片段的擴(kuò)增及序列測(cè)定用PCR方法以MTB H37Rv為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到453 bp的目的片段（Fig 1）. 挑取含插入片段的陽(yáng)性克隆pGEMfurA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增的furA與Genbank公布的序列完全相同. 2.2表達(dá)載體的構(gòu)建pGEMfurA經(jīng)BamH和Hind雙酶切后的目的片段與pRSETA進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定，切出453 bp片段的為陽(yáng)性克隆子（Fig 2），命名為pRSETAfurA 1,2,3. 2.3融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化將pRSETAfurA1轉(zhuǎn)化入E.coli BL21,

13、 SDSPSGE電泳顯示有目的蛋白表達(dá).進(jìn)行可溶性分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白有約80位于菌體蛋白的可溶性上清中（Fig 3）.上清直接經(jīng)過(guò)鎳離子柱進(jìn)行親和層析純化，得到Mr約為23.0×103的目的蛋白（Fig 4）. 2.4純化蛋白的Westernblot鑒定純化后的HisFurA融和蛋白以鼠抗(His)6 mAb為一抗，山羊抗小鼠抗體為二抗進(jìn)行蛋白印跡分析，純化蛋白在Mr為23.0×103處有明顯的免疫雜交帶（Fig 5）. 3討論 鐵作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌都是必須的，但是攝入過(guò)多的鐵會(huì)形成羥基引起細(xì)胞毒作用，所以細(xì)菌內(nèi)有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)控制鐵的濃度. 在大多數(shù)細(xì)菌中，這項(xiàng)功

14、能主要由Fur執(zhí)行. Fur可以調(diào)控一系列的生理反應(yīng)包括調(diào)節(jié)鐵的攝入量和調(diào)控毒力基因的表達(dá)4-6. 在調(diào)節(jié)鐵攝入的過(guò)程中，F(xiàn)ur作為阻遏蛋白可以與二價(jià)鐵形成穩(wěn)定的復(fù)合物,該復(fù)合物與鐵調(diào)控基因上游長(zhǎng)度19 bp的操縱子序列結(jié)合，從而達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄減低細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的目的. 在環(huán)境中缺鐵的情況下，F(xiàn)ur蛋白不能與這些序列結(jié)合，相應(yīng)的基因序列則去阻遏鐵的攝取增加7. 目前關(guān)于Fur蛋白的研究主要局限于大腸桿菌，而MTB中Fur蛋白研究得較少. MTB有兩個(gè)調(diào)節(jié)鐵攝入的直向同源基因，分別為furA和furB. 它們?cè)诨蛐蛄泻偷鞍捉Y(jié)構(gòu)上與大腸桿菌中的Fur蛋白有很高的同源性，所以推斷它們與大腸桿菌Fur蛋

15、白有相似的功能，在MTB的鐵代謝中起了非常重要的作用，但是目前這個(gè)功能還沒(méi)有被證實(shí). FurA蛋白有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域： DNA結(jié)合區(qū)和鐵結(jié)合區(qū). 根據(jù)它的結(jié)構(gòu)分析它的功能除了在細(xì)菌鐵代謝中其重要作用外，還可能作為調(diào)節(jié)因子調(diào)控下游基因的表達(dá). 在分枝桿菌所有種屬中，furA都是直接位于katG基因的上游，而katG基因可以編碼過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶，它是MTB的主要毒力因子.轉(zhuǎn)錄物作用圖表明katG是由一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的,但是它自身并沒(méi)有這個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，目前認(rèn)為其上游的furA可能作為katG基因的啟動(dòng)子，并調(diào)控katG基因的表達(dá)8,9. 我們通過(guò)設(shè)計(jì)MTB furA特異性引物，采用PCR方法從MTB H

16、37Rv DNA庫(kù)中擴(kuò)增出目的片段furA，序列測(cè)定與Genbank完全一致.為使融合基因得到高效及穩(wěn)定的表達(dá)以及考慮到將來(lái)的純化工作，我們構(gòu)建了(His)6融合表達(dá)載體pRSETAfurA，在大腸桿菌BL21中獲得了高效表達(dá). pRSETA表達(dá)載體為2900 bp，核糖體結(jié)合位點(diǎn)下游接有6個(gè)組氨酸，其后有一小腸激酶的酶切位點(diǎn)，雙鏈環(huán)狀，Amp抗性，多克隆位點(diǎn)有11個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)及T7啟動(dòng)子，F(xiàn)urA克隆入此載體，表達(dá)產(chǎn)物Mr為23.0×103，在此位點(diǎn)也應(yīng)有(His)6的表達(dá)，因此通過(guò)檢測(cè)組氨酸的表達(dá)，可間接表明FurA的表達(dá). 同時(shí)(His)6的表達(dá)為進(jìn)一步純化蛋白提供了親

17、和位點(diǎn)，它可與Ni2+特異性結(jié)合，通過(guò)Ni2+NTA親和色譜柱可得到純化的目的蛋白. Western blot鑒定確為FurA蛋白，最后將融合蛋白通過(guò)Ni2+NTA金屬螯合親和層析柱純化得到了FurA蛋白，為進(jìn)一步研究其在MTB鐵攝取中的作用及對(duì)katG基因的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ). 【參考文獻(xiàn)】 1 Ratledge C. Iron, mycobacteria and tuberculosis J. Tuberculosis (Edinb), 2004; 84(12):110-130. 2 Rodriguez GM, Voskuil MI, Gold B, et al. ideR, An ess

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