游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞瘦素受體基因、蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化的影響

1、游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞瘦素受體基因、蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化的影響 作者：郭啟煜高妍叢琳邵寧生 【關(guān)鍵詞】 脂肪酸類 關(guān)鍵詞:脂肪酸類;瘦素受體;肌，骨骼/細(xì)胞學(xué) 摘 要:目的 探討游離脂肪酸是否會對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體的基因、蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗及葡萄糖代謝的異常. 方法 分離、培養(yǎng)新生Sprague-Dawley大鼠骨骼肌細(xì)胞，分別與軟脂酸（0.25mmol・L-1 ）或油酸（0.125mmol・L-1 ）孵育12，24和36h，提取蛋白后用Western印跡法檢測Leptin受體的蛋白水平.用RT

2、-PCR檢測胰島細(xì)胞內(nèi)Leptin受體RNA含量的變化.應(yīng)用免疫沉淀法檢測Leptin受體的酪氨酸磷酸化程度. 結(jié)果 軟脂酸和油酸孵育后大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體的蛋白表達(dá)水平在孵育12和24h后同對照組相比無顯著變化，在孵育36h后同對照組相比顯著下調(diào)軟脂酸（0.36±0.03）和油酸（0.35±0.04）vs對照（0.39±0.05），P<0.05;Leptin受體的RNA水平在孵育12h后同對照組相比無顯著變化，孵育24和36h后顯著下調(diào)24h:軟脂酸（0.26±0.03）和油酸（0.26±0.04）vs對照（0.31&

3、#177;0.03），P<0.05;36h:軟脂酸（0.25±0.04）和油酸（0.23±0.03）vs對照（0.292 / 19±0.01），P<0.05;Leptin受體的酪氨酸磷酸化程度在在孵育12h后同對照組相比無顯著變化，孵育24和36h后顯著下調(diào)24h:軟脂酸（0.17±0.05）和油酸（0.15±0.06）vs對照（0.21±0.07），P<0.05;36h:軟脂酸（0.15±0.04）和油酸（0.13±0.04）vs對照（0.24±0.06），P&

4、amp;lt;0.05. 結(jié)論 游離脂肪酸可對大鼠骨骼肌Leptin受體的基因及蛋白表達(dá)水平以及磷酸化程度產(chǎn)生一定的抑制作用，從而進(jìn)一步引起胰島素抵抗. Keywords:fatty acids;leptin receptors;muscle，skeletal/cy-tology Abstract:AIM To investigate effect of free fatty acid on gene and protein expression and tyrosine phosphorylation of leptin receptor in rat skeletal muscle cel

5、ls.METHODS Skeletal muscle cells were isolated from new born Sprague-Dawley rats.After rat skeletal muscle cells were incubated with palmitate（0.25mmol・L-1 ）or oleate（0.125mmol・L-1 ）for12h，24h and36h，Western bolt was used to as-sess the protein abundance of Leptin-receptor in r

6、at skeletal muscle cells.The RNA expression level of Leptin-receptor was revealed by RT-PCR.The tyrosine phosphorylation of Leptin-receptor was revealed by immuno-precipitation.RESULTS After being incubated with free fatty acids（palmi-tate and oleate）for12and24h，there was no difference of the protei

7、n content of leptin receptor among rat skeletal mus-cle cells treated by palmitate and oleate and control cells（P>0.05）.The protein abundance of leptin receptor in rat skeletal muscle cells significantly decreased compared with control after incubated with palmitate and oleate for36h palmitat

8、e（0.36±0.03）and oleate（0.35±0.04）vs control（0.39±0.05），P<0.05.The RNA contents of leptin re-ceptor in rat skeletal muscle cells were similar to control after being incubated with palmitate and oleate for12h（P>0.05），but significantly decreased after24or36h 24h:palmitate（0

9、.26±0.03）and oleate（0.26±0.04）vs control（0.31±0.03），P<0.05;36h:palmitate（0.25±0.04）and oleate（0.23±0.03）vs control（0.29±0.01），P<0.05.The tyrosine phosphorylation of Leptin-receptor remarkably reduced after being incubated with palmitate and oleate for24or3

10、6h 24h:palmitate（0.17±0.05）and oleate（0.15±0.06）vs control（0.21±0.07），P<0.05;36h:palmitate（0.15±0.04）and oleate（0.13±0.04）vs control（0.24±0.06），P<0.05.CONCLUSION Free fatty acids（palmi-tate and oleate）may down-regulate leptin receptor gene ex-pression and

11、suppress its tyrosine phosphorylation in rat skeletal muscle cells and may contribute to the occurrence of insulin resistance through inhibiting glucose metabolism and insulin action. 0 引言 肥胖是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率逐年上升，根據(jù)1998年WHO報告，肥胖已成為全世界最常見的流行病1 .肥胖與胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)2，3 .肥胖者很容易產(chǎn)生高游離脂肪酸血癥，而血漿游離脂肪酸過高是引起

12、胰島素抵抗的因素之一4，5 .但對游離脂肪酸是如何引起胰島素抵抗的機(jī)制目前尚無定論.瘦素（leptin）是肥胖基因（obesity gene，OB）編碼的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的作用 6 .有研究表明，脂肪組織分泌的瘦素可能是引起胰島素抵抗的機(jī)制之一7 .有研究表明瘦素受體（OB-R，Leptin receptor）與胰島素下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在“對話（cross talk）”.我們研究游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞瘦素受體的影響，探討肥胖導(dǎo)致胰島素抵抗的可能機(jī)制. 1 材料和方法 1.1 材料 新生36d Spraque-Dawley（SD）大鼠.由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供.軟脂酸、

13、油酸、膠原酶和胰蛋白酶為美國Sigma產(chǎn)品.DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所產(chǎn)品;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為英國Amersham公司產(chǎn)品.游離脂肪酸灌注液的配制:前述脂肪酸儲備液與生理鹽水混合，體積比例為110，同時加入肝素10L（100U・L-1 ）. 1.2 方法 處死新生Spraque-Dawley大鼠，取后肢股四頭肌，剪碎后用膠原酶和胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞.用含100mL・L-1 胎牛血清的199細(xì)胞培養(yǎng)基，37培養(yǎng).待細(xì)胞生長并融合時，分別加入含軟脂酸（0.25mmol・L-1 ）或

14、油酸（0.125mmol・L-1 ）的199培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12，24和36h.同時設(shè)立空白對照.裂解細(xì)胞后提取蛋白，用BioRad微量蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度. 1.2.1 Western印跡法檢測骨骼肌細(xì)胞Leptin受體的蛋白水平 取各樣本50g蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS- PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入一抗（K-20，購自美國Santa Cruz）孵育;洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育.充分洗滌后與ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑、購自英國Amer-sham）反應(yīng)，即刻與Kadak X-Omat底片曝光，洗片后用Leica Q550-IW圖像分

15、析儀（德國）進(jìn)行掃描，測定光密度（A），進(jìn)行定量分析. 1.2.2 RT-PCR檢測骨骼肌細(xì)胞的Leptin受體RNA水平 提取骨骼肌細(xì)胞總RNA.取RNA1g進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，形成cDNA，再進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）.條件為:95預(yù)變性5min;951min，5545s，7250s，共30循環(huán)，最后72延伸10min.引物由北京賽百盛生物工程公司合成.引物序列為:肥胖蛋白受體（OB-R）:5-GCG GAT CCG GAA TGA GCA AGG TCA AAA C-3，5-CGT CTA GAG TGA CTT CCA TAC GCA AAC C-3;擴(kuò)增片斷長度為477bp.內(nèi)對照-ac

16、tin:5-GAA TTC ATG TTT GAG ACC TTC AA-3，5-CC GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A-3;擴(kuò)增片斷為326bp.取5L PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1X TBE.對瘦素受體和內(nèi)對照-actin擴(kuò)增條帶進(jìn)行掃描分析，計算光密度（A）.根據(jù)OB-R（A）/-actin（A）的比值，對瘦素受體的RNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析. 1.2.3 用免疫沉淀法檢測Leptin受體的酪氨酸磷酸化程度 蛋白的提取同Western蛋白印跡法.免疫沉淀的基本流程:取提取的組織蛋白樣品500g，加入抗OB-R抗體10L，4輕搖2h，

17、加入蛋白A-瓊脂糖20L，4輕搖過夜.41000g離心，棄上清.PBS1mL懸浮沉淀，41000g離心5min，洗滌沉淀.重復(fù)3次.41000g離心，棄上清，留沉淀.上樣緩沖液加入沉淀，煮沸5min，離心后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳.電泳分離蛋白同Western blotting，轉(zhuǎn)膜方法和條件同前，封閉，封閉液為含50g・L-1 卵清蛋白的TTBS緩沖液，室溫輕搖1h.加入抗磷酸酪氨酸抗體，用TBS緩沖液稀釋抗磷酸酪氨酸抗體（1500），將膜和適量的抗體稀釋液放入雜交袋，4輕搖過夜.洗膜同前，加入二抗，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（110000），與膜室溫孵

18、育1h.ECL增強(qiáng)發(fā)光，曝光同前. 統(tǒng)計學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x ±s表示，組間顯著性差異采用t檢驗(yàn). 2 結(jié)果 2.1 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體蛋白水平的影響 Western印跡法檢測顯示，在Mr120000處可見瘦素受體的雜交條帶.經(jīng)軟脂酸和油酸作用12，24h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體蛋白量與同期對照組相比無顯著變化（P>0.05）.經(jīng)軟脂酸和油酸作用36h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體蛋白量與同期對照組相比及與同組16h相比顯著下降（P<0.05）.由數(shù)據(jù)分析可發(fā)現(xiàn)，隨著孵育時間的延長，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體蛋白水平持續(xù)下降（

19、Tab1）. 表1 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體蛋白水平的影響略 2.2 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體RNA含量的影響 根據(jù)RT-PCR結(jié)果分析，經(jīng)軟脂酸和油酸孵育12h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體RNA含量與同期對照組相比無顯著下降（P>0.05）;經(jīng)軟脂酸和油酸孵育24及36h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體RNA含量顯著下降（P<0.05）;且隨時間延長，有繼續(xù)下降的趨勢（Tab2）. 表2 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體RNA含量的影響略 2.3 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞中瘦素受體酪氨酸磷酸化免疫沉淀的檢測結(jié)果 經(jīng)軟

20、脂酸和油酸孵育12h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體酪氨酸磷酸化程度與同期對照組相比無顯著下降（P>0.05）;經(jīng)軟脂 酸和油酸孵育24及36h后，骨骼肌細(xì)胞Leptin受體酪氨酸磷酸化程度對照組相比顯著下降（P<0.05）;且隨時間延長，有繼續(xù)下降的趨勢.瘦素受體的酪氨酸磷酸化程度顯著降低，提示游離脂肪酸抑制了大鼠骨骼肌細(xì)胞瘦素受體的酪氨酸激酶活性（Tab3）. 表3 游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞瘦素受體酪氨酸磷酸化的影響略 3 討論 肥胖是型糖尿病非常重要的危險因素8，9 ，肥胖患者普遍存在著脂代謝異常，其脂肪分解速率和血漿游離脂肪酸都是增高的，血漿游離脂肪酸（FF

21、A）是聯(lián)系肥胖和胰島素抵抗或高胰島素血癥的一個重要環(huán)節(jié)10-12 .瘦素（Leptin）是由1994年首次克隆到的肥胖基因（obesity gene，ob gene13 ，位于人類染色體7q32）編碼的一種由167個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)14 ，是一種脂肪組織源激素，具有廣泛的生物效應(yīng).瘦素受體基因又叫糖尿病基因（diabetes gene，db），是Leptin的高親和力受體，瘦素通過與瘦素受體的結(jié)合而影響著機(jī)體許多生理系統(tǒng)和代謝通路，在控制體脂、能量平衡等方面發(fā)揮作用15 .Leptin受體屬于類細(xì)胞因子受體超家族，一方面可通過JAK/STAT蛋白發(fā)揮作用，受體胞內(nèi)區(qū)（ICD）發(fā)生磷酸化

22、，磷酸化的ICD提供了STAT蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合磷酸化受體ICD后STAT蛋白被激活，激活后的STAT蛋白移入核內(nèi)，刺激胰島素的轉(zhuǎn)錄;另一方面，又可通過有絲分裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）和磷脂酰肌醇3激酶（phos-phatidylinositol3-kinase）途徑調(diào)控能量代謝和體質(zhì)量平衡.許多研究發(fā)現(xiàn)胰島素與Leptin存在著相互作用16 .Leptin水平的降低，并不僅僅因?yàn)轶w質(zhì)量的下降.胰島素刺激Leptin分泌，Leptin也通過胰島細(xì)胞上的受體來抑制胰島素的分泌，在胰島素和Leptin之間存在著一個雙向的反饋環(huán).瘦素與胰島素抵抗之間

23、有密切關(guān)系17，18 .本結(jié)果表明，軟脂酸和油酸孵育后大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體的蛋白表達(dá)水平在孵育12和24h后同對照組相比未發(fā)生顯著變化，但在孵育36h后同對照組相比顯著下調(diào);Leptin受體的RNA水平在孵育12h后同對照組相比無顯著變化，孵育24和36h后顯著下調(diào)，說明短時間的高游離脂肪酸水平尚未對大鼠骨骼肌細(xì)胞中的Leptin受體的蛋白表達(dá)水平和基因表達(dá)水平造成顯著影響，但如果延長對高水平的游離脂肪酸的暴露時間，則會對Leptin受體的蛋白表達(dá)水平和基因表達(dá)水平造成顯著影響.Leptin受體的酪氨酸磷酸化程度在孵育12h后同對照組相比無顯著變化，孵育24和36h后顯著下調(diào).結(jié)果表

24、明，高游離脂肪酸孵育24h雖然未對Leptin受體的基因及蛋白表達(dá)造成顯著影響，但卻降低了Leptin受體的酪氨酸磷酸化程度，這提示游離脂肪酸首先抑制了大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體的酪氨酸激酶活性，這必然會對Leptin的信號傳導(dǎo)造成一定的抑制作用.隨暴露時間的延長，先對Leptin受體的基因表達(dá)水平造成抑制，然后對Leptin受體的蛋白表達(dá)水平造成抑制.高游離脂肪酸對Leptin受體作用的機(jī)制尚不清楚.游離脂肪酸對大鼠骨骼肌細(xì)胞Leptin受體基因及蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化所產(chǎn)生的抑制作用，也許意味著游離脂肪酸與Leptin之間通過Leptin受體存在著一定的相互協(xié)調(diào)機(jī)制.但游離脂肪酸是否可

25、通過對Leptin受體的作用，從而影響Leptin的生理作用，改變機(jī)體的能量代謝需進(jìn)一步深入研究. 參考文獻(xiàn): 1Bjomtorp P.Obesity:A chronic disease with alarming preva-lence and consequences J.J Int Med，1998;244（2）:267-269. 2Ford ES，Williamson DF，Liu S.Weight changes and diabetes incidence:Findings from a national cohort of US adults J.Am J Epidemiol，1

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