糖尿病大鼠心肌組織中Survivin蛋白表達(dá)的影響

1、糖尿病大鼠心肌組織中Survivin蛋白表達(dá)的影響 作者：馬計(jì) 張端蓮 高凌 李培安【摘要】 目的：研究糖尿病大鼠心肌組織中Survivin蛋白表達(dá)與糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究。方法：按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和糖尿病組(20只) ,各組大鼠禁食12h 后,實(shí)驗(yàn)組大鼠以60mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌(streptozotocin,STZ)溶液,正常對(duì)照組大鼠(NC)注射等體積的枸櫞酸鹽緩沖液，觀察動(dòng)物飲水、進(jìn)食及尿量變化等情況。一周后,采尾血測(cè)血糖,以血糖濃度> 16.6mmol/ L 、飲水量> 40 ml/ d 、尿糖強(qiáng)陽(yáng)性的大鼠作為糖尿病大鼠，然

2、后將各組大鼠處死,切取心室肌組織,進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：正常對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒，Survivin蛋白呈陰性表達(dá)；糖尿病組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，Survivin蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。圖像分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和糖尿病組平均光密度分別為0.0792±0.0034、0.2985±0.0152，正常對(duì)照組和糖尿病組陽(yáng)性面積率分別為0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常對(duì)照組與糖尿病組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論：Survivin蛋白對(duì)心肌細(xì)胞凋亡起著重要

3、作用。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病 心肌 Survivin蛋白 免疫組化1 / 18糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種多病因的代謝疾病，由于胰島素分泌缺陷和（或）胰島素作用缺陷從而引起糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常，特點(diǎn)是慢性高血糖。高血糖得不到有效控制可能損害血管和神經(jīng)，最終導(dǎo)致慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、心血管病變、糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病神經(jīng)病變和性功能障礙等。因此，糖尿病早期診斷和治療可以減少發(fā)生并發(fā)癥的危險(xiǎn)性。心肌細(xì)胞凋亡不僅由特定的基因調(diào)控, 還受細(xì)胞周圍的刺激信號(hào)誘導(dǎo)或抑制, 外源性因子可通過一定途徑發(fā)揮刺激效應(yīng)。目前的研究表明, 影響心肌細(xì)胞凋亡的因素很

4、多, 歸納起來, 主要有物理性、化學(xué)性以及生物性因素3大類, 這些因素中有生理性的或病理性的, 也有促發(fā)性的或抑制性的。存活素(suvrvini)是新近發(fā)現(xiàn)的AIP家族新成員，目前認(rèn)為其可抑制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的終末效應(yīng)子caspase-3而發(fā)揮抗凋亡作用1。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察了高血糖引起的心肌細(xì)胞的凋亡作用，旨在討論和尋找治療糖尿病和保護(hù)心肌的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種SD大鼠30只,雄性,體重180200g ,由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組 按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和糖尿病

5、組(20只) ,各組大鼠禁食12h 后,實(shí)驗(yàn)組大鼠以60mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌(streptozotocin ,STZ)溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的構(gòu)櫞酸鹽緩沖液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常對(duì)照組大鼠(NC)注射等體積的枸櫞酸鹽緩沖液，觀察動(dòng)物飲水、進(jìn)食及尿量變化等情況。一周后,采尾血測(cè)血糖,以血糖濃度> 16.6mmol/ L ,飲水量> 40 ml/ d ,尿糖強(qiáng)陽(yáng)性的大鼠作為糖尿病大鼠，然后將各組大鼠處死,切取心室肌組織,進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間,密切觀察動(dòng)物進(jìn)食和飲水量變化,每周稱兩次體重。1.

6、2.2 主要試劑 濃縮型兔抗鼠Survivin單克隆抗體盒(北京中山生物技術(shù)有限公司) ；超敏即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司) ；顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）。1.2.3 主要儀器 YWY781型醫(yī)用微波儀（250 W，50 Hz），浙江臨安電子器材廠生產(chǎn)；家用高壓鍋。1.2.4 常規(guī)HE染色 以上各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完畢后,將各組動(dòng)物從心底部剪取心臟,切下心室。4%多聚甲醛固定、包埋、石蠟切片、HE染色。1.2.5 免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)Survivin蛋白相關(guān)抗原 主要步驟： 組織切片5 m，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗； 3%過氧化氫，37孵育10

7、 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗4×5min； Survivin采用微波抗原修復(fù)（3檔，10 min）， PBS洗4×5min； 正常羊血清37孵育10 min以減少非特異性反應(yīng)； 一抗37孵育1h，PBS洗4×5min； 生物素標(biāo)記的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min； 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物37孵育10 min，PBS洗4×5min； DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)； 蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。 用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。1.2.6 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 Survivin蛋白以胞漿出現(xiàn)棕

8、黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)Survivin蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。 （陽(yáng)性面積率單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100）1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率作單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水

9、準(zhǔn)為0.05。2 結(jié)果 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒，Survivin蛋白呈陰性表達(dá)；糖尿病組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，Survivin蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。圖像分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和糖尿病組平均光密度分別為0.0792±0.0034、0.2985±0.0152，正常對(duì)照組和糖尿病組陽(yáng)性面積率分別為0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常對(duì)照組與糖尿病組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。表1 正常對(duì)照組與糖尿病組心肌細(xì)胞內(nèi)Survivin表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積

10、率（略）注：* 正常對(duì)照組與糖尿病組比較，P0.05。3 討論 糖尿病是目前臨床學(xué)科中進(jìn)展最迅速的學(xué)科之一。隨著對(duì)糖尿病研究的不斷深入,人們已逐漸認(rèn)識(shí)到糖尿病的本質(zhì)是血管病變。1999年,美國(guó)心臟學(xué)會(huì)提出,糖尿病是一種心血管疾病。目前,大血管病變是糖尿病患者死亡的主要原因,事實(shí)上,如果糖尿病沒有血管并發(fā)癥,糖尿病將不再是一個(gè)重大的公共健康難題。 在糖尿病大血管病變形成過程中,胰島素抵抗、內(nèi)皮功能紊亂和局部RAS激活等起重要作用。胰島素抵抗在代謝綜合征的形成中起重要作用,是心血管疾病(CVD)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。胰島素抵抗可在2型糖尿病發(fā)生2030年前就存在,在糖尿病發(fā)病前就可能對(duì)心血管系統(tǒng)造成不可

11、逆損害。UKPDS研究證實(shí),新診斷的2型糖尿病患者中有近50%出現(xiàn)了大血管并發(fā)癥的臨床證據(jù)。胰島素抵抗的表型很多,除糖尿病外,還可導(dǎo)致高血壓、慢性全身性疾病和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等,并最終形成動(dòng)脈粥樣硬化。可以說,胰島素抵抗是2型糖尿病與CVD的橋梁。RAS與糖尿病之間關(guān)系密切,糖尿病患者局部組織內(nèi)RAS的激活和AT1受體對(duì)AngII的高敏感可能獨(dú)立于系統(tǒng)RAS。內(nèi)皮功能失衡是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)和核心環(huán)節(jié),2型糖尿病在血管病變出現(xiàn)前數(shù)年就有內(nèi)皮功能受損的標(biāo)志物升高,而且內(nèi)皮功能受損還常與胰島素抵抗合并存在,兩者相互協(xié)同,共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。代謝綜合征包括的各種心血管危險(xiǎn)因素均可引起內(nèi)皮細(xì)胞

12、功能紊亂,所以維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能平衡,單純依靠控制血糖遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,只有全面控制心血管危險(xiǎn)因素,才能最終實(shí)現(xiàn)降低2型糖尿病心血管疾病發(fā)生率和死亡率的目的。 近年來,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者經(jīng)過臨床和流行病學(xué)調(diào)查,以及周密設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究和實(shí)驗(yàn)研究,雖然對(duì)糖尿病的病因有了較多的認(rèn)識(shí),但對(duì)原發(fā)性糖尿病的病因仍然不清楚。有實(shí)驗(yàn)研究證明糖尿病性心肌病的特征性改變?yōu)殚g質(zhì)改變和微血管改變。Karnafel發(fā)現(xiàn)糖尿病性心肌病的病理改變有微血管變窄、微動(dòng)脈瘤形成、心肌肥大、膠原結(jié)構(gòu)改變、心肌纖維化及血管周的纖維化。在糖尿病性心肌病中,心臟功能改變有心絞痛、心力衰竭和心律失常,左心室舒張功能障礙是糖尿病性心肌病的早期標(biāo)志之一 。

13、Cai等研究發(fā)現(xiàn),高血糖可直接導(dǎo)致活體心肌細(xì)胞凋亡,高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡至少部分是通過細(xì)胞色素C 激活的caspase-3 途徑的激活而控制。Cai等報(bào)道在糖尿病患者和動(dòng)物模型中都可觀察到心肌細(xì)胞死亡,通過抗氧化劑或凋亡信號(hào)途徑的特異性抑制劑抑制心肌細(xì)胞死亡,可以明顯的阻止糖尿病的心臟毒性,因此心肌細(xì)胞死亡在糖尿病性心肌病變中有重要作用。 Survivin 是凋亡蛋白抑制劑( Inhibitor of apoptotic protein, IAP) 家族的新成員24, 于1997年由耶魯大學(xué)的Altieri 等應(yīng)用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1 (EPR-1) 的cDNA 通過雜交方法在人類基因組

14、文庫(kù)中篩選并鑒定出來, 是迄今克隆出的最小的IAP。它特異性地表達(dá)于胚胎發(fā)育組織及分化未成熟組織，并在幾乎所有惡性腫瘤組織中出現(xiàn)高表達(dá)5，6, 而在正常成人組織中不表達(dá)(胸腺、胎盤、子宮內(nèi)膜除外), 并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)710。 本研究結(jié)果顯示，存活素在正常對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)不明顯，存活素在糖尿病組心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高。這一表達(dá)差異提示，糖尿病組細(xì)胞中存活素的過度活化可能與心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其可能通過阻斷凋亡，破壞細(xì)胞增殖/凋亡平衡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Temme A , R iegerM , Reber F, et al. Localization,dynamics, a

15、nd function of survivin revealed by expression of functional survivinD sRed fusion proteins in the living cell. Mol Biol Cell, 2003，14(1)78.2 Salvesen GS, Duckett CS. IAP proteins: blocking the road to deaths door. Nat Rev Mol cell Biol,2002，3 (4)401.3 王誠(chéng), 馮一中, 顧永平. 人胰腺癌組織中凋亡抑制蛋白Survivin 的表達(dá)及其臨床意義.

16、蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004，24(4)515.4 劉偉, 朱艷芳, 李敏. 應(yīng)用組織芯片研究凋亡抑制基因Survivin 在胃癌中的表達(dá). 臨床消化病雜志,2005，17 (1)20.5 Matsumoto G, Muta M , Umezawa K, etal.Enhancement of the caspase-independent apoptotic sensitivity of pancreatic cancer cells by DHM EQ, an NF-KappaB inhibitor. Int J Oncol,2005，27(5)1247.6 劉江偉,李開宗,竇科峰,等

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