銀杏葉提取物對局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號TLR4表達的影響

1、銀杏葉提取物對局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號TLR4表達的影響【摘要】 目的 觀察銀杏葉提取物對局灶性腦缺血(FCI)大鼠腦組織Toll樣受體4基因(TLR4)、蛋白表達的作用。方法 參照Longa等方法制造FCI大鼠模型，將60只Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、和銀杏葉提取物組，分別采用RTPCR法及免疫組化法檢測缺血灶周圍腦組織TLR4基因、蛋白表達水平。結果 模型組TLR4基因相對表達均明顯高于假手術組(P<0.01) ;銀杏葉提取物組TLR4相對表達量明顯低于模型組(P<0.01) ;TLR4蛋白表達類似于基因相對表達。結論 模型組大鼠缺血灶周

2、圍腦組織TLR4基因高表達，銀杏葉提取物對TLR4表達有抑制作用，這可能是其抗炎作用的機制之一。 【關鍵詞】 銀杏葉提取物;腦梗死;大鼠;Toll樣受體4腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病之一，尤其腦梗死(CI)具有較高的發(fā)生率、致殘率、病死率，CI后缺血損傷的機制復雜，其中過度的炎癥免疫反應存在于CI后壞死及缺血區(qū)域，導致炎性損傷，此已成共識，因此減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死(ACI)的主要途徑之一，研究證實TLR4與非生物性炎性損傷關系密切1，2。銀杏葉味甘、苦、澀，性平，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛功效，其主要有效成分銀杏葉提取物(GBE)已被廣泛應用于腦血管疾病3、認知功能障礙4、炎癥5等

3、相關疾病的治療，但其對CI的研究鮮有報道。本實驗觀察銀杏葉提取物對CI大鼠腦組織TLR4基因及蛋白表達的影響，探討銀杏葉提取物抗CI的可能作用。2 / 151 材料與方法1.1 動物與試劑 健康雄性Wistar大鼠60只，300350 g，由吉林大大學動物實驗中心提供許可證號DK04032007，清潔級。銀杏葉提取物為河北石家莊神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的舒血寧注射液，5 ml/支，折合銀杏葉提取物為17.5 mg。NAR ISH IGE SR6N腦立體定向儀(日本);電子天平(日本AND HR120，精確度為0.1 mg);RTPCR相關試劑(美國Promeg公司);引物合成(上海生工生物工程技術

4、服務有限公司合成);PCR擴增儀(德國Eppendorf，Mastercycler gradient);低溫離心機(德國Eppendorf，Centrifuge 5417R)，凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE)。1.2 實驗方法 將60只大鼠隨機分為：假手術組，模型組和銀杏葉提取物組。每組又分為6、12、24和48 h，4個亞組，每亞組均為5只大鼠。假手術組大鼠不插線，模型組及銀杏葉提取物組線栓法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞的動物模型。各組均為腹腔給藥，將藥物以蒸餾水制成相同濃度混懸液(40 mg/ml)，模型組及假手術組均給予1 ml生理鹽水，于手術完畢后3 h給藥1次，之后每天1次，直至相應

5、時間點處死動物，取前囟前2 mm至前囟后3 mm腦組織，以進針點為界分為前后兩部分，前部分取梗死灶周圍腦組織，快速稱取100 mg，置于冰浴中的勻漿器并迅速勻漿，用于抽提總RNA。后部分腦組織用4%多聚甲醛固定液固定，4下持續(xù)固定2448 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，在切片機上連續(xù)冠狀切片，片厚5 m，-20保存。1.3 RTPCR檢測血腫周圍腦組織TLR4 mRNA的表達1.3.1 梗死灶周圍腦組織總RNA抽提與純化 在冰浴勻漿器中加入1 ml Trizol及100 mg組織，迅速研磨，將勻漿液裝于EP管中，加入200 l氯仿劇烈震搖30 s，間隔放冰盒保溫，反復震蕩， 4， 12 0

6、00 r /min，低溫離心20 min，取上層水相轉移至另一EP 管中，加等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20過夜， 4， 12 000 r/min，低溫離心20 min，棄上清，加75%乙醇700 l輕輕混勻，4，12 000 r/min，低溫離心10 min，輕輕吸出上清，室溫垂直放置2030 min涼干，加入DEPC水20 l溶解，留取1 l待測RNA濃度。1.3.2 逆轉錄(RT合成第1條鏈cDNA) 在PCR管中建立如下反應體系：依次加入如下試劑： 5×RT緩沖液5 l、dNTP (10 mmol/L) 2.5 l、Rnasin 1 l、Primer 1 l、M2MLV 1

7、l，RNA及DECP水總共14.5 l。短暫離心振蕩混勻4低溫短暫離心;在PCR儀中，37反轉錄50 min，95 5 min滅活反轉錄酶，立即冰浴，-20保存。1.3.3 聚合酶鏈式反應(PCR)TLR4引物的設計 GenBank中查到TLR4序列號為( #AF057025)，用Gene Toll軟件設計TLR4上游引物為5GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T3(2 4422 463)，下游引物為5ATG GGT TTTAGG CGC AGA GTT T3(2 7762 795)，PCR反應條件為預變性95×2 min后，變性95×40 s，退火52

8、×40 s,延伸72×1 min，35個循環(huán)后72延伸10 min，PCR產(chǎn)物為356 bp。內參照actin引物序列為：上游5GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA3，下游5GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG3，擴增產(chǎn)物為375 bp。PCR反應條件：預變性95×2 min后，變性95×30 s,退火52×30 s，延伸72×40 s; 35個循環(huán)后，最后延伸72×5 min。1.4 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定 各樣品PCR產(chǎn)物5 l(actin 5 l)加于2%瓊脂糖凝膠電泳槽齒孔中，取PCR標

9、準同時電泳，作為標準分子量參照。1×TBE 50 V恒壓電泳4060 min，取膠置凝膠成像系統(tǒng)中，紫外光下拍照，結果掃入電腦備處理。1.5 免疫組化染色 免疫組化染色采用SABC法，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H2O2/甲醛溶液中15 min，以消除內源性過氧化物酶活性，浸入0.01 mol/L、pH6.0枸櫞酸鹽緩液中，加熱至9298熱修復抗原， 20 min后冷卻至室溫，0.01 mol PBS(pH 6.0)振洗5 min×3次，正常山羊血清封閉液孵育30 min。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1400)， 4孵育過夜。0.01 molPBS

10、(pH 6.0)振洗5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，37 孵育45 min。吸去二抗，0.01 mol PBS(pH 6.0)振洗5 min×3次;加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37孵育30 min。0.01 mol PBS (pH 6.0)振洗5 min×3次，DAB顯色，適時終止反應;蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。陰性對照以PBS代替一抗。1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較運用單因素方差分析，兩兩比較運用q檢驗，所有數(shù)據(jù)用SAS軟件處理。2 結 果2.1 各組腦組織TLR4 mRNA

11、相對表達 各組各時間點TLR4 mRNA 均表達，與假手術組相比模型組各時間點TLR4mRNA相對表達均明顯升高，且在24 h達高峰，持續(xù)到48 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01) ;銀杏葉提取物組TLR4 mRNA相對表達明顯低于模型組(P<0.01)，見表1，圖1。表1 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA相對表達水平的比較1)與模型組比較，2)與6，12 h組比較：均P<0.01，下表同圖1 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA表達2.2 各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達 假手術組各時間點偶有TLR4少量表達;TLR4表達以小膠質細胞為主，位于細胞胞漿內

12、。模型組在觀察的時間段內6、12、24及48 h TLR4蛋白表達明顯增多，于缺血后24 h達高峰，持續(xù)大約48 h。銀杏葉提取物組TLR4蛋白相對表達明顯低于模型組(P<0.01)，見表2。表2 各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達3 討 論銀杏葉提取物抗炎、抗氧化及免疫調節(jié)作用正逐漸受到重視。腦缺血損傷見于許多臨床病理過程，影響這一過程的因素是多方面的。一般認為，腦缺血損傷是典型的非感染性炎癥損傷，氧自由基產(chǎn)生、炎癥介質釋放是其重要機制。然而，在臨床試驗中抗炎治療并沒有效果，或許這些藥物抑制炎癥通路的效果有限。長期以來對炎癥發(fā)生機制缺乏清晰的認識妨礙了人們對炎性細胞因子在腦缺血損

13、傷中的作用給出合理的解釋。近年認為TLR4在非生物性炎癥損傷中起重要作用1，2。TLR4的結構及其參與促炎反應、促進免疫細胞成熟分化及調節(jié)免疫應答等方面研究的較為清楚。目前已證實人和鼠腦內有眾多的TLR4表達6，TLR4廣泛分布腦室周圍血管叢，小膠質細胞，星形膠質細胞，腦內血管平滑肌細胞和內皮細胞也表達TLR4 mRNA。多種PAMP如肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白以及氧應激，氧自由基等均可激活TLR4，最終引起TNF，ILs等前炎癥因子的激活，導致多種炎癥因子的瀑鏈式釋放而產(chǎn)生生物學效應。TLRs家族不僅識別外源性微生物，而且識別內源性有害物質7，如參與調節(jié)機體對壞死細胞、熱休

14、克蛋白、細胞外基質降解產(chǎn)物等的應答。最近研究證實8，9TLR4在誘導的中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著關鍵作用，小膠質細胞是損傷介質的主要來源。TLR4作為炎性跨膜受體在感染性疾病研究領域中已是熱點。本研究中假手術組各時間點TRL4 mRNA相對表達變化無差異,模型組6、12、24、48 hTLR4 mRNA相對表達明顯增多，于缺血后24 h達高峰，并持續(xù)到48 h，與模型組比較銀杏葉提取物組能顯著降低腦出血大鼠TLR4 mRNA的相對表達，TLR4蛋白表達類似于基因表達。由此可以推斷，局灶性腦缺血后損傷組織釋放的內源性激活物被TLR4識別后，啟動了TLR4的信號傳導通路，并進一步激活NFB而釋放致炎細胞

15、因子而造成組織損傷。而銀杏葉提取物可以降低TLR4基因、蛋白的表達，從而抑制之后一系列瀑布式炎癥損傷，并最終減輕腦水腫，而其具體機制尚需進一步的實驗研究?！緟⒖嘉墨I】 1 Li C，Ha T，Kelley J,et al.Modulating Tolllike receptor mediated signaling by (13)betaDglucan rapidly induces cardioprotectionJ. Cardiovasc Res，2004;61 (3)：53847.2 Cao CX，Yang QW，LV FL,et al.Reduced cerebral ischemia

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