TM4SF9在大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤細(xì)胞株中的表達及意義

1、TM4SF9在大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤細(xì)胞株中的表達及意義 作者：耿焱，姜泊，賴卓勝，張宏權(quán)，馬文敏，王新穎 【關(guān)鍵詞】 ,大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤 Expression and significance of TM4SF9 in laterally spreading colorectal tumor【Abstract】 AIM: To investigate different expressions of TM4SF9 in laterally spreading tumor (LST), Lovo and SW480 cell lines and to study the relationship

2、 between TM4SF9 mRNA expression and the adhesion ability of these cell lines. METHODS: Common different expression genes among those cell lines were detected by microarray technology and TM4SF9 was screened out for further research. Semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT

3、PCR) technology was used to demonstrate the result and the adhesion ability was tested by adhesion experiment. RESULTS: Microarray showed that there was a common differential expression in TM4SF9 among LST, SW480 and Lovo cell lines and this result was determined by semiquantitative RTPCR. Adhesion

4、experiment indicated that the cell line with the highest TM4SF9 expression showed the best adhesion ability. CONCLUSION: There exists a common different expression in TM4SF9 among LST, SW480 and Lovo cell lines. TM4SF9 is overexpressed in Lovo which has the strongest adhesion ability and may regulat

5、e specific biological functions of LST.2 / 16【Keywords】 laterally spreading tumor; TM4SF9; protein array analysis; reverse transcriptase polymerase chain reaction【摘要】 目的： 研究四分子交聯(lián)體5（TM4SF9）在大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤（laterally spreading turmor, LST）、SW480和Lovo細(xì)胞中的差異表達，以及TM4SF9表達差異與三個細(xì)胞株黏附能力的關(guān)系. 方法： 用基因芯片技術(shù)研究3個細(xì)胞株的共同差

6、異表達基因，從中篩選出TM4SF9作為研究對象，用半定量RTPCR技術(shù)驗證基因芯片檢查結(jié)果，用黏附實驗研究3個細(xì)胞株黏附性的差異. 結(jié)果： 基因芯片檢查發(fā)現(xiàn)TM4SF9在3個細(xì)胞株中都有表達，Lovo細(xì)胞株表達最強，LST表達最弱，半定量RTPCR檢查與基因芯片檢查結(jié)果相符，黏附實驗顯示TM4SF9表達水平最高的細(xì)胞黏附性最強. 結(jié)論： TM4SF9在LST，SW480，LOVO 3個細(xì)胞株中存在差異表達，黏附性較強的細(xì)胞株表達較高，其與LST特性的關(guān)系值得進一步研究.【關(guān)鍵詞】 大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤；四分子交聯(lián)體5；蛋白質(zhì)陣列分析；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)0引言平坦型大腸腫瘤包括表淺型和凹陷型，表淺

7、型以大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤（laterally spreading turmor, LST）為代表1. LST特點是極少向腸壁深層垂直侵犯，而主要沿黏膜表面呈側(cè)向淺表擴散2. LST的癌變率可達8.4%52.0%，并可以在3年內(nèi)發(fā)展成為進展期大腸癌2，3. 我國目前對LST病變的研究尚屬空白. 研究LST側(cè)向生長及高惡變傾向的分子生物學(xué)機制，有可能對早期大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程提供有價值的資料及線索，并在分子水平上找到早期診斷的可靠依據(jù). 我們通過基因芯片研究LST, Lovo, SW480 3個細(xì)胞株的差異表達基因，篩選出四分子交聯(lián)體5或稱跨膜4超家族成員9（transmenberance 4 su

8、perfanily 9, TM4SF9）作為研究對象，用半定量RTPCR驗證，用黏附實驗研究3個細(xì)胞株黏附性的差異與TM4SF9表達水平的關(guān)系，以探討TM4SF9與LST側(cè)向生長及高惡變傾向的分子生物學(xué)機制的關(guān)系.1材料和方法1.1材料大腸LST細(xì)胞株為南方醫(yī)科大學(xué)消化病研究所建株并保存4. SW480和Lovo大腸癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所. 人類全基因表達譜分析芯片（HC10001）中科開瑞生物芯片公司；Trizol試劑Gibco公司；RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis KitFermentas公司；PreMix

9、PCR試劑盒賽百盛公司；TM4SF9基因片段引物參照基因文庫NM_005723序列設(shè)計，GAPDH參照文獻4設(shè)計，博亞公司合成，序列: TM4SF9: sense (197) 5TTGTGGTGGGAGGAGTGAT3, antise (444) 5 CT GGGTGAAGTCTATGAGGTT3; GAPDH: sense 5 CCATGGAGAAGGCTGGGG3, antise 5 CAAAGTTGTCATGGATGACC3. 3K30高速低溫離心機Sigma公司；UNO II PCR擴增儀Biometra公司；UVI凝膠成像系統(tǒng)Collagen ISigma公司； 48孔培養(yǎng)板Corn

10、ing公司.1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)3個細(xì)胞株均在37 50 mL/L CO2條件下，培養(yǎng)于含10 mL/L小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640中,每周傳代2次.1.2.2基因芯片5,6用Trizol提取200 g總RNA，按照Oligotex mRNA spincolumn protocal分離純化mRNA. 用通用測序PCR引物擴增中科開瑞科技股份有限公司所提供的18 816個基因克隆作為模板. 表達譜芯片由2個半張大小為8 cm×12 cm尼龍膜組成. 每半張芯片上排列384個小矩陣（16×24），每個探針在矩陣中排布2點，平

11、均點樣量20 ng. 正方形方陣右上角設(shè)空白點作陰性對照，每4個方陣設(shè)1個陽性對照，在選定方陣的右下方（方陣外）. 整張芯片共有8個看家基因，為常見的核蛋白體蛋白、核糖體蛋白等. BG600點樣儀點樣，紫外交聯(lián)，晾干備用. 在逆轉(zhuǎn)錄體系中加入mRNA 0.75 g，MMLV酶2 L，a33PdATP 10 L標(biāo)記，按Promega公司提供說明操作. 預(yù)雜交結(jié)束后，棄去預(yù)雜交液，加入雜交液6 mL，變性過的魚精DNA （100 mg/L）60 L和40 L標(biāo)記好的探針. 置入雜交爐中68雜交20 h. 雜交后嚴(yán)格洗膜，測量膜正面Counts，磷屏壓片72 h. FLA3000掃描儀掃描芯片信號圖

12、像，ArrayGauge1.0軟件分析. 判定基因差異表達的標(biāo)準(zhǔn)： 一對樣本的信號平均值2或個2而另個10；信號值變異系數(shù)0.33 ；信號平均值有2倍以上表達差異的基因.1.2.3半定量RTPCR取5 g總RNA，按RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明合成cDNA.第一鏈. 取cDNA和兩對引物（20 moL/L）各1 L加入50 L標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中（成份見說明書），94預(yù)變性2.5 min，然后進入以下32個循環(huán)： 94變性45 s，68退火1 min，72延伸1 min. 循環(huán)完畢，72延伸5 min. 實驗結(jié)果

13、重復(fù)3次，取5 L擴增產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，UVI凝膠成像系統(tǒng)成像，gelpro analyser3.2軟件做半定量分析. PCR擴增產(chǎn)物測序交博亞公司完成.1.2.4黏附實驗LST, SW480, Lovo細(xì)胞株各組，每組設(shè)3個孔. 取細(xì)胞對數(shù)生長期，用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜. 10 g/L collageon 溶液（1×PBS配制）每孔150 L，置37鋪板1 h. 10 g/L BSA（1×PBS配制）煮沸13 min變性后，每孔加200 L封閉1 h，封閉結(jié)束后用1×PBS沖洗2次. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，1×P

14、BS洗滌細(xì)胞，800 r/min, 5 min離心沉淀細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞重懸于含氯化鈣1 mmol/L，氯化鎂1 mmol/L，氯化錳0.21 mmol/L及5 g/L BSA的RPMI1640中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L. 按200 L/孔加入細(xì)胞懸液，37溫育1 h. 取出48孔板，1×PBS沖洗5次，33 g/L甲醛固定，相差顯微鏡下每空隨機取6個高倍鏡視野計數(shù).統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換，在方差齊性的基礎(chǔ)上應(yīng)用方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果 2.1基因芯片性能尼龍

15、膜上LST, SW480, Lovo重復(fù)點的R2分別為0.9716(y=0.9773x), 0.9858(y=0.9794x)和0.9823(y=0.9959x)，提示芯片重復(fù)性好. LST, SW480, Lovo細(xì)胞株之間符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異表達基因97個，其中共上調(diào)58個，共下調(diào)39個. 差異表達的基因按功能分類顯示以信號傳導(dǎo)傳遞、代謝、發(fā)育和分化類為最多. 選擇TM4SF9作為研究對象. TM4SF9屬于信號傳導(dǎo)傳遞、發(fā)育和分化類基因，在LST，SW480和Lovo中的信號值分別為0.6712, 4.9445和15.7723, Lovo較LST上調(diào)表達20倍，較SW480上調(diào)表達10倍.

16、2.2基因分析瓊脂糖凝膠電泳顯示TM4SF9和GAPDH擴增片斷大小分別在247 bp和195 bp （Fig 1），測序結(jié)果證實為TM4SF9基因片斷. 實驗重復(fù)3次，LST, SW480, Lovo相對表達量（TM4SF9/GAPDH）分別為0.340.08, 0.580.07, 0.780.11, F值為19.235(P<0.01)，其中LST低于SW480, Lovo （P<0.05），SW480低于Lovo （P<0.05）.2.3LST黏附細(xì)胞LST黏附細(xì)胞數(shù)明顯少于Lovo （P<0.001）和SW480 （P&lt

17、;0.001）, Lovo的黏附細(xì)胞數(shù)多于SW480 （P<0.01）. TM4SF9表達最強的Lovo細(xì)胞株黏附性最強(Tab 1).表1LST, SW480, LOVO黏附細(xì)胞數(shù)（略）3討論四分子交聯(lián)體（tetraspanin）超家族，又稱跨膜4超家族（transmenberance 4 superfanily, TM4SF），是一組以四次跨膜及兩個大小不等的細(xì)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主要特征的膜表面蛋白7. TM4SF成員可通過彼此間以及其他類型膜表面蛋白的聯(lián)系，形成四分子交聯(lián)體網(wǎng)（tetraspanin web），調(diào)節(jié)細(xì)胞的運動性，激發(fā)同類型的細(xì)胞的聚集，多種類型細(xì)胞的融合，以及細(xì)

18、胞的信號傳導(dǎo)，對惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有重要影響8. 目前對TM4SF9的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)，它可以影響小鼠的神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的黏附、運動和增殖9,10，鮮有其與大腸癌關(guān)系的報道. 我們在研究發(fā)現(xiàn)，在LST, SW480, Lovo細(xì)胞株中存在著TM4SF9差異表達，黏附能力最強的Lovo細(xì)胞株表達最強，提示TM4SF9可能與大腸癌細(xì)胞的粘附能力有關(guān). 基因芯片顯示差異表達的基因以信號傳導(dǎo)傳遞、代謝、發(fā)育和分化類為最多，而TM4SF9屬于信號傳導(dǎo)傳遞、發(fā)育和分化類基因，提示TM4SF9可能與LST的特殊生物學(xué)行為有關(guān). 我們將對其做進一步的研究，一方面為解釋LST側(cè)向生長及高惡變傾向

19、的分子生物學(xué)機制奠定基礎(chǔ)，一方面加深對TM4SF9功能的了解，以期發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因.【參考文獻】1姜泊，劉思德. 重視平坦型大腸腫瘤的臨床診治 J. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2004; 29(11): 925-927.Jiang B, Liu SD. Pay emphasis to the dianosis and treatment of flat tumors of colon J. Med J Chin PLA, 2004; 29(11): 925-927.2Nakagoe T, Ishikawa H, Sawai T, et al. Gasless, video endoscopic t

20、ransanal excision for carcinoid and laterally spreading tumors of the rectum J. Surg Endosc, 2003; 17 (4):1298-1304.3Tamura S, Nakajo K, Yokoyama Y, et al. Evaluation of endoscopic mucosal resection for laterally spreading rectal tumors J. Endoscopy, 2004; 36 (1):306-312.4賴卓勝，韓宇晶，劉思德，等. 大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤細(xì)胞株

21、的建立及其鑒定J. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2004; 29(11): 934-937.Lai ZS, Han YJ, Liu SD, et al. Establishment of a novel epithelial cell line from laterally spreading tumor of colon J. Med J Chin PLA, 2004; 29(11): 934-937.5范德剛，范清宇，張惠中，等. 利用基因芯片技術(shù)篩選不同轉(zhuǎn)移能力骨肉瘤細(xì)胞差異表達基因J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2003; 24(9): 816-819.Fan DG, Fan QY, Zhang HZ, et al. Study on metastasis associated gene in osteosarcoma by cDNA microarray J. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(9): 816-819.6楊磊，顧永清，潘澤民，等. 長期砷誘導(dǎo)L02細(xì)胞的表達譜基因芯片實驗J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004;25(13): 120