葉綠素的提取與含量測定

1、才巧y丿叨實驗報告課程名稱：植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)老師：成績:實驗名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測定 實驗類型同組學(xué)生姓名：一、實驗?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┤嶒灢牧吓c試劑（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填）七、實驗結(jié)果與分析（必填）二、實驗內(nèi)容和原理（必填）四、實驗器材與儀器（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得一、實驗?zāi)康暮鸵螅?. 掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定。2. 掌握定量分析的原理和方法。二、實驗內(nèi)容和原理：以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進行理化性質(zhì)測定和葉綠素含量分析。 原理如下：1. 葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機溶劑，常用95%

2、的乙醇或80%的丙 酮提取。2. 皂化反應(yīng)。葉綠素是二撥酸酯，與強堿反應(yīng)，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機溶劑中的類胡蘿卜素分開。3. 取代反應(yīng)。在酸性或加溫條件下，葉綠素嚇咻環(huán)中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。4. 葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。5. 定量分析。葉綠素吸收紅光和藍紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a, b及總量，而652可直接用于總量分析。三、實驗材料與試劑材料：青菜葉試劑：KOH固體、醋酸銅粉末、醋酸四、主要儀器設(shè)備：1. 天平（萬分之一）、可掃描分光光度計、離心機2. 研具

3、、PE管、酒精燈等五、操作方法和實驗步驟（必填）1. 定性分析：熒光現(xiàn)象：鮮葉3-5g+95%乙醇15ml （逐步加入），磨成勻漿,過濾入三角瓶, 觀察熒光現(xiàn)象皂化反應(yīng)：加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油瞇lml和H:0 lml,分層后觀察取代反應(yīng)：加醋酸約lml,觀察顏色，取1/2加醋酸銅粉，加熱變 亮綠 色2. 葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測定：皂化反應(yīng)的上層黃色石油醸溶液（稀釋470nm 0D ）,在400-700nm處掃描光譜，分別測定類胡蘿卜素的吸收峰反復(fù)用石油瞇粹取，直到無類胡蘿卜素，離心得葉綠素（鹽），（稀釋663nm0D ）,分別測定葉綠素的吸收峰3 葉綠素定量分析：鮮葉，力口，磨成

4、勻漿，取2份加80%丙酮,搖勻，4000轉(zhuǎn)離心3min,上清液在645, 652, 663測定OD,計算Chia, Chib和Chi總量的値。六. 實驗數(shù)據(jù)記錄和處理1.熒光現(xiàn)象：透射光綠色，反射光 紅光2皂化反應(yīng)：上層呈黃色,為類胡蘿卜素，吸收藍紫光。下層呈綠色。為葉綠素。吸收藍紫光和紅光。皂化反應(yīng)分層3. 類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定:上層黃色溶液掃描光譜吸收峰為 468nm> 439nm 413nm> 667nm 和 606nm 五個 下層綠色溶液掃描光譜去鎂葉綠素銅代葉綠吸收峰為414nm> 526nm、639nm三個4. 取代反應(yīng):加醋酸約lml,變褐（去鎂 葉

5、綠素） 取1/2加醋酸銅粉加熱變亮綠色,為銅代葉綠素。素5. 葉綠素含量測定波長/nm吸光度（第一組）吸光度（第二組）645652663根據(jù)公式：CagL二 0D645Cksb/L>= 0D652? 1000/Chia 含量（mg/二（ca（a,.1）/1000）?2/ ?5/Chib 含量（mg/ =（Ct/1000） ?2/ ?5/Chi總含量（mg/ =（Ct）/1000）?2/ ?E求得：C&產(chǎn) mg/ LC&2二 nig/ LCb 產(chǎn) mg/ LCb：= mg/LCn= mg/LCt： mg/LChia 含量 1 = mg/Chia 含量 1 = mg/Chib

6、 含量 1 = mg/Chib 含量 1= mg/Chi總含量1= mg/Chi總含量1= mg/七、實驗結(jié)果與分析類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：類胡蘿卜素的吸收峰為藍紫光區(qū)468nm> 439nm、413nm三個峰，在紅光區(qū)667nm和606nm的峰說明葉綠素有殘留。葉綠素在藍紫光區(qū)有414nm、526nm兩個峰，在紅光區(qū)有639nm 個峰，藍紫光區(qū)的 峰比紅光區(qū)的高，說明葉綠素吸收藍紫光的能力比紅光強。葉綠素含量測定：Chia 含量 1 = mg/ Chia 含量 1 = mg/Chib 含量 1 = mg/ Chib 含量 1= mg/Chi總含量1= mg/ Chi總含量1=

7、 mg/兩組測定結(jié)果中葉綠素a與葉綠素b含量之和與用663nm求得的總?cè)~綠素含量比較 接近，說明實驗結(jié)果較為理想，可能造成實驗誤差的因素有：1. 研磨后的葉綠素溶液中仍存在固體，可能堵塞移液槍管口，造成吸入的溶液量不準確2. 比色皿未清洗干凈，造成測得的吸光度改變3. 分光光度計存在儀器誤差八、討論、心得思考題：1. 為什么葉綠素吸收紅光和藍紫紫光葉綠素的能級有基態(tài)（G）,第一單線激發(fā)態(tài)（E1）,第二單線激發(fā)態(tài)（E2）和三 線激發(fā)態(tài)（E3）,光子吸收必須遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必須等于基態(tài)和 激發(fā)態(tài)的能量差。藍紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2,而紅光能量 小，只能使其躍遷到E1,故葉綠素只能吸收藍紫光和紅光。2. 為什么可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜因為由于葉綠素皂化反應(yīng)后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結(jié)構(gòu)，葉綠 素對光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對光的吸收規(guī)律兒乎是相同的，而且皂化反應(yīng)可以從 葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素 鹽來測定葉綠素的吸收光譜。討論:1皂化反應(yīng)后的黃色溶液需用石油瞇萃取多次，如果萃取補充分，會有葉綠素殘留， 在掃描吸收光譜時除了在468nm、439nm、413