IgAFc受體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)的機(jī)理研究

1、IgAFc受體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)的 機(jī)理研究3 月第 21 卷第 2期 Chinj 掩哦王 n n es（igaIC）andspecificmonoofonalafibodyweusedto,slJlntl- Jateunodegnmulation.Izctofewinreleasedbysfimulatedneutrophilswasquantitativdydetermined.Re tmltsMoncdonalJ®db0曲andIICcouldbothinducen剛hupllactofewinreleaseHowever,monoelonalanlibodyinduc

2、edrapidandstmttgdegranulafionwhilsttheeffectofgAIC m muchB n k 町.（刪 |帥_npatternof rleutID 【IIlildegranulationinducedbyrgAICarmmonoclonalantibodyisdifferentSub.ieetwords Fcreceptor;Neutropfil:DegranttlationIsA通過與細(xì)胞表面的IgAFc受體（礎(chǔ)）結(jié)合 發(fā)揮作用.多種髓樣細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞，單核細(xì) 胞，嗜酸性細(xì)胞都表達(dá) FcaR：現(xiàn)在已知FcaR在髓 樣細(xì)胞中可以介導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)，如脫顆粒反應(yīng)

3、，呼 吸爆發(fā)，吞噬反應(yīng)，細(xì)胞因子的釋放以及胞內(nèi)c離子濃度的增加等.它也能夠促進(jìn)ADCC（antibody- dependentcel1.mediatedcy ' tc,toXidty）'據(jù)報(bào) 道,游離的IsA可以與FcaR結(jié)合，但并不引起細(xì)胞活 化，只有FcaR在交聯(lián)X態(tài)下，如用單克隆抗體或是 聚合的I,才能引起細(xì)胞活化.FR在進(jìn)行信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)需要靠其他膜蛋白或胞漿內(nèi)蛋白的協(xié)助來 完成.現(xiàn)已知FcaR在跨膜區(qū)域有一個(gè)帶正電荷的 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助（l和397ff/28;英國 皇家學(xué)會訪問學(xué)者項(xiàng)目資助豐項(xiàng)目部分內(nèi)容在英國劍橋大學(xué)分子免疫病理研究所完成作者單位：1000

4、05北京.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院畢渡（佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生）.張偉， 石敏鹿通信作者：張偉【E-mail:zw83423hotmallo_ 皿） 精氨酸，它和FcRT鏈的帶負(fù)電荷的天冬氨酸靠靜電 吸引形成復(fù)合物，并通過7一鏈進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo).在 FcRT鏈存在的情況下，交聯(lián)FcaR引起胞外鈣離子的 涌人和胞內(nèi)酪氫酸磷酸化作用，在沒有FcRY鏈的情 況下，交聯(lián)FcaR不能引起細(xì)胞的活化.本文是我們 對FcaR介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)的研究結(jié)果材料和方法主要試劑：胃蛋白酶，F(xiàn)ITC交聯(lián)的抗小鼠IgG,無 鈣鎂HBSS干粉，無內(nèi)毒素小牛血清白蛋白，MOPC.2J,細(xì)胞

5、松弛素 B均由Sigma公司提供；Percol1分離 液,DextranT500,I由Phannacia公司提供；乳鐵蛋 白由Calbiochem公司提供；EGTA由AMRESCO 公司 提供；Iodogen由PierceandWarriner公司提供；兔抗小 鼠IgG,兔抗乳鐵蛋白抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗乳 鐵蛋白抗體由本室自制：MPSa,可溶性FcaR,I交 聯(lián)的葡聚糖珠，NIP交聯(lián)的小牛血清白蛋白(NIP- BSA),抗NIPIsA抗體由英國劍橋大學(xué)分子免疫病理和研究所提供，M1P8a腹水經(jīng)蛋白A柱親和層析純 化M1P8a和兔抗小鼠G抗體經(jīng)胰蛋白酶消化得F(ab),片段末消化的抗體用蛋白

6、A吸附除去.中性粒細(xì)胞的分離：健康獻(xiàn)血者新鮮外周血，肝 素抗凝在1%的Dexfm】T5o0和5mrUL的EDTA 中混勻.室溫靜置沉降30min.上清液中的白細(xì)胞懸 浮于HBSS中,加在不連續(xù)的Pe.0u分離液上(底層 78%Percoll，上層 54%Percol1),400g 離心 30min. 離心后的中性粒細(xì)胞層用 HBSS清洗2遍后再懸浮 于HBSS中備用，懸浮液中所含中性粒細(xì)胞一般在 95%以上卜lIPSa對中性粒細(xì)胞 FmR的結(jié)合作用:42+ 個(gè)中性粒細(xì)胞懸浮在 100id清洗液(PBS,01%疊氮 鈉,1%BSA)中，加入不同濃度的 MIP8a,冰浴30 min;清洗3遍后每管

7、加入1001d50倍稀釋的FlTC 一抗 小鼠I,再冰浴30min.清洗3遍，用柏01%的 多聚甲醛溶液固定后用流式細(xì)胞儀檢測.MOPC 21為同型抗體陰性對照Fear對IgA的結(jié)合作用：可溶性FcaR用lodo gen法進(jìn)行Nn標(biāo)記，標(biāo)記后的產(chǎn)物過 SephadexG- 25柱除去防I離的 NaI.I標(biāo)記的可溶性n中加 入501tlIgA葡聚糖珠，室溫置旋轉(zhuǎn)混合器混和1h.用2%BSMHBSS清洗3次,在1277型7計(jì)數(shù)儀 (Phammcia)上對葡聚糖珠進(jìn)行放射性計(jì)數(shù) 脫顆粒反應(yīng)的測定：當(dāng)lgAIC用于激活中性粒 細(xì)胞時(shí).抗NIPI(60tm1)與NIP-BSA先以最適濃 度比在含有 1.

8、5mmollLMgCl 和 lrrmaol/Lcack 的 HBSS中混合,37孵育3h.抗NIPI與NIP-BSA 最適濃度比按文獻(xiàn)4所述方法確定.然后在96孔 培養(yǎng)板中將5OI11(3加入lo0的中性粒細(xì)胞懸 液(含4MO+個(gè)細(xì)胞及7.5' ml細(xì)胞松弛素 B), 在37' :C反應(yīng)至預(yù)定的時(shí)間.當(dāng)MIPSa用于激活中性 粒細(xì)胞時(shí).25i*1MIPSaF(ab)片段與1001的中性粒 細(xì)胞懸液混合，室溫放置10min,然后每L加入25 兔抗小鼠IF(ab):片段(120,g/m1).37反應(yīng)至預(yù) 定的時(shí)問當(dāng)M n )8a用于封閉中性粒細(xì)胞表面 Fo 時(shí),25ulMIPSaF

9、(ab)片段先與100tl的中性粒細(xì)胞 懸液混合，室溫放置10min,然后每孔加入25 n ltea IC(12m1),37反應(yīng)至預(yù)定的時(shí)間.反應(yīng)完畢，將中性粒細(xì)胞上清液與細(xì)胞離心分離用雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中乳鐵蛋白 的含量.96孔板用兔抗乳鐵蛋白抗體包被，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗乳鐵蛋白抗體作為第二抗體.由已知m_J.Mardl2001V21.No2濃度的乳鐵蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)各點(diǎn)均為3個(gè)平行孔的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果應(yīng)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有代表性的一次.結(jié)果1 .M 口 P8a與中性粒細(xì)胞膜 Fear的結(jié)合:細(xì)胞膜 表面有許多蛋白質(zhì)分子，它們之間相互遮蔽，一般來

10、 說，蛋白質(zhì)分子僅是部分暴露.M1P8a若能夠交聯(lián)或 封閉中性粒細(xì)胞的,F的抗原決定簇必須暴 露出來，這樣MIP8a才能夠與其結(jié)合為此我們采 用了流式細(xì)胞技術(shù)對其進(jìn)行了檢測與同型抗體陰 性對照MOPE 21相比,MIP8a與中性粒細(xì)胞反應(yīng)后 的熒光強(qiáng)度顯著增高，說明W P8a能與細(xì)胞膜上FeaR特異性結(jié)合(圖1).Fluorescenceintensity圍1流式細(xì)胞儀測定 M n鉗對中性粒細(xì)胞表面Fear的結(jié)合作用Fig1.ettmm-y 口 Ja 岫啤 to XU? tn 蝴 Fear2 .M 口 P8a對FeaR功能的抑制作用：為了能夠有 效地封閉中性粒細(xì)胞Fear的功能,MIP8a的抗

11、原結(jié)合位應(yīng)位于FeaR用于結(jié)合IgA的功能部位將I 標(biāo)記的可溶性FmR先與tO,交聯(lián)的葡聚糖珠一起培 養(yǎng).再將游離的可溶性I FeaR洗掉.對I#交聯(lián)的 葡聚糖珠進(jìn)行放射性計(jì)數(shù).結(jié)果顯示放射性強(qiáng)度很 高,說明可溶性Fc已與I交聯(lián)的葡聚糖珠結(jié)合 (圖2).若用I標(biāo)記的可溶性FeaR與未交聯(lián)有Iga 的葡聚糖珠反應(yīng)，洗去游離可溶性I F的葡聚糖 珠沒有放射性，說明可溶性FeaR對IgA交聯(lián)的葡聚 糖珠的結(jié)合是特異性的.若在I標(biāo)記的可溶性Fear與IgA交聯(lián)的葡聚糖珠一起培養(yǎng)時(shí)加入MIP8a,洗去游離可溶性受體后葡聚糖珠的每分鐘放射性計(jì) 數(shù)比不加皿P8a時(shí)的放射性計(jì)數(shù)低 95%,說明MIP8a 可以

12、有效地封閉可溶性受體對tO,交聯(lián)的葡聚糖珠的結(jié)合.生 1000 q10030ChinJMicrtiolInu:d,M 眥 h20O1,Vol21,No2 圍2M晴h對可溶性Fctr.R與A交聯(lián)的葡聚糖珠結(jié) 合的抑制rig2 BloddngFctr.Rbi.al,etobeadsbyM 嘲 a A:MIPSaB:Negative;C:Positive我們還從另一個(gè)角度觀察了MIP8a的抗原結(jié)合位是否位于%0R用于結(jié)合tgA的功能部位.已知 IgAIC可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)，這個(gè)反應(yīng) 是由%0R介導(dǎo)的.若MIPSa的抗原結(jié)合位位于 FcaR用于結(jié)合IgA的功能部位，它應(yīng)能抑制IgAIC 誘導(dǎo)

13、的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)為此，我們先用不 同濃度的MIPSaF(ab對中性粒細(xì)胞表面 FcaR進(jìn) 行封閉，再加入IIC觀察脫顆粒反應(yīng).圖3表明， MIPSaF(ab)2濃度為18釁,ml時(shí)即可完全抑制lgA Ic介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng).可見,MIPSa能特異性結(jié)合 F鋤并抑制其與IgA結(jié)合M1PSaaddedluwell圈3MIPSaF(曲)2對IgAIC介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)的抑制 3.1nifibitlanofIC-inducedbreJe 黯 ebyM n 10n,然后再加入兔抗鼠IgG以達(dá)到交聯(lián)FcaR的目 的為了防止中性粒細(xì)胞與 MIPSa和兔抗鼠lgG的 n部分結(jié)合，通過細(xì)胞表面的lgGFc受體

14、介導(dǎo)產(chǎn)生 脫顆粒，我們將IMIPSa和兔抗鼠lgG預(yù)先酶解去掉 部分，使反應(yīng)只可能通過 FcaR介導(dǎo)進(jìn)行.結(jié)果表 明MIPSa交聯(lián)F可以產(chǎn)生脫顆?，F(xiàn)象，但是與 lgAIC相比，二者引起的脫顆粒反應(yīng)有著不同的時(shí) 間反應(yīng)曲線(圖4).IIC誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆 粒在最初一段時(shí)間里反應(yīng)極其微弱，約30min后乳鐵蛋白的釋放量緩慢增加，3h后仍未達(dá)峰值；而 M1P8aF(ab),交聯(lián)FeaR介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的脫顆 粒反應(yīng)迅速，在5min內(nèi)即可有強(qiáng)烈的脫顆粒反應(yīng)，并在15min乳鐵蛋白的釋放量接近峰值.f)4080 2016020 ” 1圍4IC和nll-a交聯(lián)Fctr.R介導(dǎo)脫顆粒反應(yīng)的時(shí) 間反應(yīng)曲線

15、rig4.Timemlofn0phjllacterrlnreleaseinduced byM 聃 aandIc4.鈣鎂離子對Fc-tR介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)的影 響:我們曾經(jīng)報(bào)道lIC誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒需要鈣鎂離子參與，為了觀察MIPSa交聯(lián)FcaR引 起的脫顆粒反應(yīng)是否也需要鈣鎂離子參與，我們使用了無鈣鎂，只有鈣沒有鎂，只有鎂投有鈣和鈣鎂同 時(shí)存在的4種反應(yīng)液以分別觀察鈣鎂離子對MIPSa交聯(lián)FcaR與tgAIC誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反唐 的影響.另外，我們還在反應(yīng)體系中加入了EDTA或EGTA.EDTA可以絡(luò)合鈣鎂兩種離子，EGTA只能 絡(luò)合鈣而不能絡(luò)合鎂.結(jié)果表明,IIC誘導(dǎo)的中 性粒細(xì)胞

16、脫顆粒反應(yīng)是依賴于鈣鎂的，只有在鈣鎂 離子同時(shí)存在條件下IgAIC才能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的 脫顆粒反應(yīng)，鈣鎂任意一種離子單獨(dú)存在時(shí)IgAIC均不能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng).與此結(jié)果不 柵.同,_W IP8a交聯(lián)Fear引起的中性粒細(xì)胞的脫顆粒反 應(yīng)不依賴于鎂.在沒有鎂離子存在的情況下(HBSS 一1mmol/Lc),中性粒細(xì)胞釋放的乳鐵蛋白與鈣鎂 離子同時(shí)存在(rmss-1nanol/Lca2.1.5mraol/LM) 時(shí)相當(dāng).從對鈣離子的需求看，盡管，P8a交聯(lián) 引起的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)受到鈣離子的影 響，但是并不完全依賴于鈣離子.在投有鈣離子存 在 flcj(HBSS-1nunoltLCa2

17、1.5nunol/LM 6.66mmolt LEGTA,HBSSqmmol/Lca21.5mraol/L.6.66 mmol/LEDTA,毋 Ss_1.5nunol/L 和無鈣鎂 HBSS),乳鐵蛋白釋放的量減少很多，但是不像tsA【C的情況那樣反應(yīng)完全消失(圖5)圈5二價(jià)離子對Ie,nic和11diP88介導(dǎo)脫顆粒反應(yīng)的 影響ng5.1lmuU ' nnnaofdlvtmt 麒 tkSrICand 11dIP88mediatedknreleaseAHBSS(EDTA):鄴 ss_l 珊 Lc15rtavol/LM-6.66 LEDTA;BHBSS(EGTA):HSS-ImlLc 1.

18、5mFL 史t-666mmollLEGTAc. BssCa,M):雌 lmmLc+15mmL ;D.Hit:6(Ca):ml L;E 口 ss( eNb):HLgS-I.5 眥 LM;FtBss:candMfreetBss5.鈣鎂離子不影響IgAIC與FouR受體的結(jié) 臺:IC誘導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)為什么依賴于鈣鎂離 子?原因尚不清楚，其中一個(gè)可能性是 FcaR結(jié)合 Iga的時(shí)候需要這些離子參加，對此我們進(jìn)行了檢 測.將Iga交聯(lián)的葡聚糖珠與I.標(biāo)記的可溶性 mlIIoI,Mar&20OI,V ol21,No2FeaR在無車鎂，只有鈣沒有鎂，只有鎂沒有鈣和鈣鎂 同時(shí)存在的反應(yīng)液反應(yīng).

19、結(jié)果表明，在HBSS-lOmmol/LEDTA,HBSS.1.5nunob%M-1nunoi/Lca2,HBSS-1.5nunol/LM 及 HBSS-1nu' nol/Lca2中，【.標(biāo)記的可溶性FeaR都結(jié)合等量IgA交聯(lián)的葡 聚糖珠，其每分鐘放射性計(jì)數(shù)無明顯差異，即IIC與FeaR受體的結(jié)合能力并不受鈣鎂二價(jià)離子的影 響（結(jié)果未顯本）.討論本文報(bào)道了用IIC或單克隆抗體 MIPSa交聯(lián)中性粒細(xì)胞表面FeoR后引起的脫顆粒現(xiàn)象.結(jié)果 表明，盡管MIPSa和IIC都可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞 脫顆粒，但二者的作用存在差異IIC誘導(dǎo)的是慢速脫顆粒反應(yīng)，該反應(yīng)依賴于鈣鎂離子，在胞外無 鈣離子或無

20、鎂離子的情況下，都不能發(fā)生反應(yīng).而 MIPSa誘導(dǎo)的是快速脫顆粒反應(yīng)，在胞外無鈣離子的 情況下，該反應(yīng)減弱.但是在胞外無鎂離子的情況 下,反應(yīng)不受影響. 一般認(rèn)為，受體介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)首先需要受體在細(xì)胞表面交聯(lián)，至于用什么樣的方法交聯(lián)并不 重要”人們通常利用單克隆抗體將表面受體交聯(lián)，用這種方式模仿受體與配體之間的反應(yīng) 如果這是 正確的，那么無論用MIPSa交聯(lián)FoolR還是用IgAIC 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生的現(xiàn)象應(yīng)該一樣 ，但是我 們的結(jié)果表明，將Fco.R作為受體和FcaR作為配體 產(chǎn)生的現(xiàn)象并不一樣.眾所周知，鈣離子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起第二信使的 作用細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高會引起一系列的反 應(yīng),包

21、括呼吸爆發(fā)，脫顆粒等等.有兩個(gè)途徑可以使 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，一是細(xì)胞外鈣離子的涌入， 一是細(xì)胞內(nèi)鈣庫的釋放.在沒有細(xì)胞外鈣離子存在 的情況下,M1PSa誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)減弱 了很多，說明此種條件下細(xì)胞只能動用細(xì)胞內(nèi)鈣庫 釋放的鈣來作為第二信使，結(jié)果鈣離子濃度的升高 較少，使反應(yīng)減弱.至于鈣在IgAIC誘導(dǎo)的脫顆粒 反應(yīng)中的作用不清楚，可能不僅僅是作為第二信使 否則當(dāng)反應(yīng)體系中有鎂參加而無鈣參加時(shí)的現(xiàn)象應(yīng) 與MtPa相同，即脫顆粒反應(yīng)僅是減弱，而不是完全 捎失M1PSa交聯(lián)Fear引起的是快速脫顆粒反應(yīng)，另外據(jù)報(bào)道，另一種抗Fear的單克隆抗體My43與中 性粒細(xì)胞反應(yīng)，也可以引起

22、快速強(qiáng)烈的脫顆粒反 應(yīng)” .IsAIC與MIPSa交聯(lián)Fear介導(dǎo)的中性粒細(xì) 啪柵枷0宣一i - 0_J 蘭il 0S2001 年 3 月第 21 卷第 2Mierolh,amol,lareh2001,V21,No.2胞的脫顆粒反應(yīng)速度不同，推測與單位細(xì)胞膜面積上聚集的FcccR的量有關(guān).MIPSaF(ab):為特異性的單克隆抗體，它與Fc親和力強(qiáng)使膜上聚集的Fedl的密度很高，故可引起快速月顆粒反應(yīng)；而tgAIc體積較大，使膜上聚集的FeaR的密度較低，故不 能引起快速反應(yīng).總之，IC與MIPSa交聯(lián)FeaR誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)行為不同.kAIC引起依賴于鈣鎂離子的慢速脫顆粒反應(yīng);MI

23、PSa引起不依賴于鎂但是部分依賴于鈣快速脫顆粒反應(yīng)，我們目前正在進(jìn)一步探索這些反應(yīng)的機(jī)理.參考文棘1sh 腫 LR 唧【for1 肌 Ph4c191mmmolRest1992,11:273,2822Y 朗 mHrLell,Ke n MA0 】凹 n 觸 ofyah n 眥 Ianu -T 瑚 帥 e 日 mdesisbybumnPD1 VI l 刪咖 uden 1k0cyt 皓 CllnB 甲 Immmol,1987,68:200-2083c 叫 LA,日 mBPs.LejhPcJ.allgA-ds.c 陀 lgA 一叩 niseiSAureusmd1 】n 咖 burst 哪鄴 y 鴨 p0

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